نظام خلية الفحص مجاني تقدير تحييد القدرات من GM - CSF جسم باستخدام المؤتلف ذوبان GM - CSF مستقبلات

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء مقايسة خالية من الخلايا لقياس القدرة التعادلية للأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F. نبدأ بالحصول على ديدان قز معدلة وراثياً. يتم إدخال جين SGMR alpha البشري لإنتاج SGMR alpha مأشوب، ثم ننتقل إلى وسم G-M-C-S-F البشري المأشوب عبر تقنية bioTE.

بعد ذلك، نقوم بتقييم الارتباط بين النظام الخالي من الخلايا والمقايسة البيولوجية المعتادة من خلال دراسة تثبيط ارتباط G-M-C-S-F بـ SGMR alpha بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها ارتباطًا كبيرًا بين تثبيط النمو في المقايسة البيولوجية وتثبيط الارتباط في النظام الخالي من الخلايا بواسطة كسور IgG المصلية والأجسام المضادة الذاتية المنقاة لـ G-M-C-S-F. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة TF one في أن هذا النظام يوفر تحليلًا عالي الدقة مع قابلية جيدة للتكرار لقياس القدرة التعادلية للأجسام المضادة الذاتية لـ GM CSF.

بما أن الأجسام المضادة الذاتية لـ GM CSF تسبب إنذاراً عاماً أولياً للمناعة الذاتية، فإن تطبيقات هذه التقنية تمتد لتشمل التشخيص. كما يمكن تطبيقها في مقاييس الارتباط التنافسي باستخدام مستقبلات السيتوكين المؤشبة، مثل مستقبلات BEGF و TNFA. سيقوم أنو، وهو طالب دكتوراه من مختبري، بتقديم عرض توضيحي لهذا الإجراء، وهو الذي طور هذا النظام الخالي من pH في البداية.

يوضح هذا الفيديو دودة القز المستخدمة لإنتاج البروتين المأشوب SGMR alpha. تتمثل الخطوة الأولى في تضخيم CDNA الخاص بـ SGMR Alpha من مكتبة CD NA لمشيمة بشرية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل، وباستخدام ناتج تضخيم PCR الناتج. يتم إجراء تفاعل PCR ثانٍ لإضافة تسلسل 5 prime UTR مكون من 50 قاعدة من poly heatron لفيروس ULA إلى الطرف five prime.

ولوسم R RRGs، يتم وصل وسمه إلى النهاية الثلاثية (three prime end)، ثم يُستنسخ ناتج PCR المضخم لـ R في البلازميد P MSG one one mg. يُحقن التركيب PS GMR slash M1 one mg مع الناقل المساعد PHA three pig في بيوض سلالة دودة القز PNDW one. تُربى يرقات الجيل G zero التي فقست حتى تتحول إلى فراشات عند درجة حرارة 25 °C. ثم تُفحص أجنة الجيل G one إما عن طريق التزاوج بين الأشقاء أو مع PNDW one من خلال تعبير MG FP في العينين، وهو ما يشير إلى ديدان القز المعدلة وراثياً التي تحمل ذلك الوسم.

يتم استخلاص بروتين SGMR alpha المؤتلف من شرانق ديدان القز المعدلة وراثياً باستخدام محلول منظم من الفوسفات يحتوي على 500 millimolar من كلوريد الصوديوم، مع التقليب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. تُطرد العينات مركزياً عند 20,000 ×g لمدة 15 دقيقة. ولإزالة الرواسب، يُمرر السائل الطافي عبر عمود ألفة من النيكل.

اغسل العمود وقم بشطف البروتينات باستخدام تدرج خطي من ole من 10 millimolar إلى 250 millimolar. اجمع الكسور التي تحتوي على SGMR alpha المُنقّى وقم بإجراء الديلزة مقابل phosphate puffed saline. ابدأ بديلزة العينات باستخدام PBS.

لإزالة السوربيتول من تحضير G-M-C-S-F، أضف 1 mL من محلول ميتا-دات الصوديوم البارد بتركيز 20 millimolar وحضن العينة لمدة 30 دقيقة على الثلج في الظلام. الآن أضف الجلسرول ليصل إلى تركيز نهائي قدره 15 millimolar وقم بإجراء الديلزة مقابل منظم أسيتات الصوديوم بتركيز 100 millimolar. للاستمرار، أضف البيوتين أزيد إلى المحلول بتركيز نهائي قدره 5 millimolar واخلط المزيج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

أخيرًا، قم بإزالة المواد غير التفاعلية عن طريق الديلزة مقابل PBS، ثم غلف طبق معايرة دقيقة بـ 50 µL من جسم مضاد أحادي النسيلة anti polyhis طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الطبق خمس مرات باستخدام PBST. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول حجب وحضنه لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C.

كرر عملية الغسل خمس مرات باستخدام PBST. أضف 50 µL من SGMR alpha في محلول الحجب، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C بعد إجراء خمس عمليات غسل باستخدام PBST. أضف 25 µL من العينات التي تحتوي على G-M-C-S-F auto antibody، ثم أضف 25 µL من biotinylated G-M-C-S-F، وقم بالتحضين لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

لتكوين معقد SGMR alpha G-M-C-S-F، استمر في الغسل خمس مرات باستخدام PBST، ثم أضف 50 µL من streptavidin الفوسفاتاز القلوي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C للكشف عن G-M-C-S-F المبيوتن المرتبط بـ SGMR alpha. اغسل خمس مرات باستخدام PBST، ثم أضف 50 µL من ركيزة التألق الكيميائي إلى المحلول، وحضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وحدد نشاط التألق الكيميائي باستخدام قارئ الأطباق. في تحليل SDS page، يتواجد SDMR alpha المؤتلف المشتق من دودة القز في كل من الشكلين أحادي القسيمة (monomeric) وثنائي القسيمة (DME) في الظروف غير المختزلة، ولكن في الشكل أحادي القسيمة فقط في الظروف المختزلة.

هذا المزيج المؤتلف من المونومرات والدايمرات المرتبطة بجسور ثنائي الكبريتيد لـ SGMR alpha فعال في مقايسة الارتباط التنافسي. يُظهر معقد G-M-C-S-F المبيوتن مع SGMR alpha خصوصية حيث يمكن تفكيكه بإضافة تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة المُحيدة، ولكن ليس الأجسام المضادة غير المُحيدة. علاوة على ذلك، ترتبط التركيزات المتزايدة من الأجسام المضادة المُحيدة لـ G-M-C-S-F إيجابياً بزيادة النسبة المئوية لتثبيط الارتباط بطريقة تعتمد على الجرعة.

كما هو متوقع، لم يكن تثبيط ارتباط الأجسام المضادة غير المُحيّدة لـ G-M-C-S-F معتمداً على الجرعة. ويُظهر هذا النظام الخالي من الخلايا ارتباطاً وثيقاً بين تثبيط ارتباط G-M-C-S-F بـ SGMR alpha بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F والقيم المحسوبة، حيث بلغت قيمة r تساوي 0.988 وقيمة P تساوي 0.002. وقد زاد تثبيط الارتباط بطريقة معتمدة على الجرعة بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F.

وبالمثل، ارتبط تثبيط الارتباط بشكل ملحوظ بتثبيط نمو import. لهذا المقايسة فائدة في تحليل كسور IgG المصلية من المرضى الذين يعانون من PAP المناعي الذاتي، كما هو موضح هنا من خلال العلاقة بين IC 50 لنسبة تثبيط الارتباط ونسبة تثبيط النمو بواسطة كسور IgG المصلية. علاوة على ذلك، يشير معامل الاختلاف بين التجارب إلى تفوق النظام الخالي من الخلايا على المقايسة الحيوية لتثبيط النمو.

بمجرد إتقانها، يمكن إتمام هذا المقايسة لربط ربيطة مستقبل GSF المعدل وراثياً الخالية من الخلايا بنجاح في غضون 38 ساعة. ومن المهم تذكر الحفاظ على درجة حرارة التفاعل ووقت الحضانة. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فحص الأنشطة البيولوجية للأدوية الجسم المضاد المبتكرة بدلاً من المقايسات البيولوجية التقليدية.