نظام خلية الفحص مجاني تقدير تحييد القدرات من GM - CSF جسم باستخدام المؤتلف ذوبان GM - CSF مستقبلات

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء مقايسة خالية من الخلايا لتقدير القدرة التعادلية للأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F. نبدأ بالحصول على ديدان قز معدلة وراثياً. يتم إدخال جين SGMR alpha البشري لإنتاج SGMR alpha مأشوب، ثم يتم وسم G-M-C-S-F البشري المأشوب عبر تقنية bioTE.

بعد ذلك، نقوم بتقييم الارتباط بين النظام الخالي من الخلايا والمقايسة الحيوية التقليدية من خلال دراسة تثبيط ارتباط G-M-C-S-F بـ SGMR alpha بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F. تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها وجود ارتباط معنوي بين تثبيط النمو في المقايسة الحيوية وتثبيط الارتباط في النظام الخالي من الخلايا بواسطة كسور IgG المصلية والأجسام المضادة الذاتية المنقاة لـ G-M-C-S-F. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة TF one في أن هذا النظام يوفر دقة تحليلية عالية مع قابلية جيدة للتكرار لقياس القدرة التعادلية للأجسام المضادة الذاتية لـ GM CSF.

بما أن الأجسام المضادة الذاتية لـ GM CSF تسبب إنذاراً عاماً أولياً للمناعة الذاتية، فإن تطبيقات هذه التقنية تمتد لتشمل التشخيص. كما يمكن تطبيقها في مقايسات الارتباط التنافسي باستخدام مستقبلات السيتوكين المؤتلفة، مثل مستقبلات BEGF و TNFA. وسيقوم ano، وهو طالب دكتوراه من مختبري، بتقديم عرض توضيحي للإجراء؛ حيث قام بتطوير هذا النظام الخالي من pH أولاً.

يوضح هذا الفيديو دودة القز المستخدمة في إنتاج البروتين المأشوب SGMR alpha. تتمثل الخطوة الأولى في تضخيم CDNA الخاص بـ SGMR Alpha من مكتبة CD NA لمشيمة بشرية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل، وباستخدام ناتج تضخيم PCR الناتج، يتم إجراء تفاعل PCR ثانٍ لإضافة تسلسل 5' UTR مكون من 50 قاعدة من poly heatron لفيروس ULA إلى الطرف الخماسي (five prime end).

ولتوسيم R RRGs، يتم دمج وسيمه في الطرف الثلاثي ('3)، ثم يُنسخ ناتج PCR المضخم لـ R في البلازميد P MSG one one mg. يتم حقن التركيب PS GMR slash M1 one mg مع الناقل المساعد PHA three pig في بيوض سلالة دودة القز PNDW one. تُربى يرقات الجيل G zero التي فقست حتى تصبح فراشات عند درجة حرارة 25 °C. بعد ذلك، يتم فحص أجنة الجيل G one إما عن طريق التزاوج بين الأشقاء أو مع PNDW one، حيث يشير تعبير MG FP في العيون إلى ديدان القز المعدلة وراثياً الحاملة للتوسيم.

يتم استخلاص SGMR alpha المؤشب من شرانق ديدان القز المعدلة وراثياً باستخدام محلول منظم من الفوسفات يحتوي على 500 millimolar من كلوريد الصوديوم، مع التقليب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. تُطرد العينات مركزياً عند 20,000 ×g لمدة 15 دقيقة. ولإزالة الرواسب، يتم تمرير السائل الطافي على عمود تقارب النيكل.

اغسل العمود وقم بشطف البروتينات باستخدام تدرج خطي من ole من 10 millimolar إلى 250 millimolar. اجمع الأجزاء التي تحتوي على SGMR alpha المُنقاة وقم بإجراء الديلزة مقابل phosphate puffed saline. ابدأ بديلزة العينات باستخدام PBS.

لإزالة السوربيتول من تحضير G-M-C-S-F، أضف 1 mL من محلول ميتا-دات الصوديوم البارد بتركيز 20 mM، واححضن العينة لمدة 30 دقيقة على الثلج في الظلام. الآن، أضف الجلسرول ليصل التركيز النهائي إلى 15 mM، ثم قم بإجراء الديلزة مقابل محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 100 mM. للاستمرار، أضف بيوتين أزيد إلى المحلول بتركيز نهائي قدره 5 mM، وامزج المزيج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

أخيرًا، قم بإزالة المواد غير التفاعلية عن طريق الديلزة مقابل PBS، ثم غطِّ صفيحة معايرة دقيقة بـ 50 µL من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ polyhis طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الصفيحة خمس مرات باستخدام PBST. ثم أضف 100 µL من محلول الحجب واحضنها لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C.

كرر عملية الغسل خمس مرات باستخدام PBST. أضف 50 microliters من SGMR alpha في محلول الحجب، ثم حضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة four degrees Celsius بعد خمس غسلات باستخدام PBST. أضف 25 microliters من العينات التي تحتوي على G-M-C-S-F auto antibody، ثم أضف 25 microliters من biotinylated G-M-C-S-F وحضنها لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة four degrees Celsius.

لتكوين معقد SGMR alpha G-M-C-S-F، استمر في الغسل خمس مرات باستخدام PBST، ثم أضف 50 µL من streptavidin الفوسفاتاز القلوي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C للكشف عن G-M-C-S-F المبيوتين المرتبط بـ SGMR alpha. اغسل خمس مرات باستخدام PBST، ثم أضف 50 µL من ركيزة التألق الكيميائي إلى المحلول، وحضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وحدد نشاط التألق الكيميائي باستخدام قارئ الأطباق. في تحليل SDS page، يتواجد SGMR alpha المؤتلف المشتق من دودة القز في كل من الشكل الأحادي (monomeric) وشكل الـ DME في الظروف غير المختزلة، بينما يتواجد الشكل الأحادي فقط في الظروف المختزلة.

يعتبر هذا الخليط المؤتلف من المونومرات والدايمرات المرتبطة بروابط ثنائي الكبريتيد لـ SGMR alpha فعالاً في مقايسة الربط التنافسي. ويُظهر معقد G-M-C-S-F المبيوتين مع SGMR alpha خصوصية عالية، حيث يمكن تفكيكه عن طريق إضافة تركيزات مختلفة من الجسم المضاد المحيّد، بينما لا يحدث ذلك عند استخدام الجسم المضاد غير المحيّد. علاوة على ذلك، ترتبط التركيزات المتزايدة من الأجسام المضادة المحيّد لـ G-M-C-S-F إيجابياً بزيادة النسبة المئوية لتثبيط الربط بطريقة تعتمد على الجرعة.

كما كان متوقعاً، لم يكن تثبيط الارتباط للأجسام المضادة غير المحيدة لـ G-M-C-S-F معتمداً على الجرعة. ويظهر هذا النظام الخالي من الخلايا ارتباطاً وثيقاً بين تثبيط ارتباط G-M-C-S-F بـ SGMR alpha بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F والقيم المحسوبة، حيث بلغت قيمة r = 0.988 وقيمة P = 0.002. وقد زاد تثبيط الارتباط بطريقة معتمدة على الجرعة بواسطة الأجسام المضادة الذاتية لـ G-M-C-S-F.

وبالمثل، ارتبط تثبيط الارتباط ارتباطاً وثيقاً بتثبيط نمو import. وتكمن فائدة هذا المقايسة في تحليل أجزاء IgG المصلية لدى المرضى المصابين بـ PAP المناعي الذاتي، كما يتضح هنا من العلاقة بين IC 50 بالنسبة المئوية لتثبيط الارتباط والنسبة المئوية لتثبيط النمو بواسطة أجزاء IgG المصلية. علاوة على ذلك، يشير معامل الاختلاف بين التجارب إلى تفوق النظام الخالي من الخلايا على المقايسة الحيوية لتثبيط النمو.

بمجرد الإتقان، يمكن إتمام هذا المقايسة لربط ربيطة مستقبل GSF في نظام خالٍ من الخلايا بنجاح خلال 38 ساعة. ومن المهم تذكر الحفاظ على درجة حرارة التفاعل ووقت الحضانة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فحص الأنشطة الحيوية للأجسام المضادة الدوائية المبتكرة بدلاً من المقايسات الحيوية التقليدية.