اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

أنا فريدريك دينا، أستاذ مشارك في علم الصيدلة هنا في جامعة ولاية أوهايو. سنقوم في هذا العرض التوضيحي بشرح كيفية الكشف عن أكسيد النيتريك والسوبر أكسيد من الخلايا باستخدام تقنية EPR Spin Trapping.

ترتبط أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية بنشوء أمراض مختلفة، ولذلك فإن الكشف عنها في الأنظمة البيولوجية يكتسب أهمية قصوى. لقد تم استخدام عدد قليل فقط من الطرق الموثوقة للكشف عن الأنواع التفاعلية في الأنظمة البيولوجية، إلا أنها محدودة من حيث النوعية والحساسية. ومع ذلك، يُستخدم إسقاط الغزل (Spin dropping) بشكل شائع لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية (eros)، ويتضمن تفاعل إضافة الجذور إلى مصيدة غزل نيتروجينية أو معقدات معدنية لتكوين ناتج إضافة غزل مستقر، والذي يمكن الكشف عنه بواسطة مطيافية الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني أو EPR؛ حيث تظهر نواتج إضافة الجذور المختلفة طيفاً مميزاً يمكن استخدامه لتحديد الجذور المتولدة، ويمكن أن يوفر وفرة من المعلومات حول طبيعة وحركية إنتاج الجذور.

يُحفز إنزيم سينثاز أكسيد النيتريك تحويل L-arginine إلى L citruline باستخدام N-A-D-P-H لإنتاج أكسيد النيتريك. وفي ظروف الإجهاد التأكسدي، يمكن أن يتحول الإنزيم من إنتاج أكسيد النيتريك إلى إنتاج السوبر أكسيد في عملية تُسمى "فك الارتباط" (uncoupling)، والتي يُعتقد أنها ناتجة عن أكسدة الهيم أو العامل المساعد. ويُعد تنظيم أكسيد النيتريك في الأنظمة البيولوجية أمرًا بالغ الأهمية، حيث يلعب دورًا حيويًا في نقل الإشارات الخلوية، مما يؤدي إلى وظائف فسيولوجية مفيدة مثل توسيع الأوعية الدموية، إلا أن إنتاجه المفرط غالبًا ما يرتبط بحالات التهابية. لذا، تبرز أهمية الكشف عن أكسيد النيتريك في الأنظمة البيولوجية.

تُعد أنواع الأكسجين التفاعلية، مثل أكسيد النيتريك، فئة أخرى مهمة من جزيئات الإشارة في الأنظمة البيولوجية؛ حيث تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية بتركيزات منخفضة دوراً هاماً في تنظيم وظائف الخلايا، والإشارات، والاستجابة المناعية، ولكنها قد تؤدي في التركيزات غير المنظمة إلى تلف تأكسدي خلوي يؤدي بدوره إلى الإجهاد التأكسدي. ويُعد أنيون جذور السوبروكسيد أحد أهم أنواع الأكسجين التفاعلية، وهو السلف الرئيسي لبعض أكثر الأنواع أكسدة المعروفة في الأنظمة البيولوجية مثل نيتريت السوبروكسيد وجذر الهيدروكسيل. لذا، فإن الكشف عن السوبروكسيد أو عزله في النظام البيولوجي أمر بالغ الأهمية، لأن توليده يمثل العلامة الأولى على حدوث الدفق التأكسدي قبل بدئه.

يقوم هذا البروتوكول بهضم خلايا بطانية شريانية بقرية مستنبتة باستخدام التربسين كما هو موضح في الإجراء المكتوب. تُنقل الخلايا إلى طبق سداسي الفجوات مُصنف، وتُحضن طوال الليل عند 37 °C و 5%CO2 بعد عملية التحضين.

أخرج لوحة الستة آبار من الحاضنة وقم بشفط الوسط من البئر الأول. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من محلول DPBS. حضّر محلول كبريتات الحديدوز سباعي الهيدرات بتركيز 1.9 mM عن طريق إضافة 0.8 mg من كبريتات الحديدوز إلى 1 mL من محلول DPBS الذي يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.

قم بتحضير محلول MGD بإضافة 2.7 milligrams من ammonium MGD إلى 500 microliters من DPBS مع calcium chloride و Magnesium chloride. أضف 210 microliters من iron sulfate hep dehydrate بتركيز 1.9 millimolar المحضر حديثاً، و 210 microliters من MGD المحضر حديثاً باستخدام نسبة مولارية قدرها واحد إلى سبعة، ثم اخلط المعلق الناتج. أضف 4.6 Microliters من calcium ion four واخلط المحلول مرة أخرى عن طريق السحب والضخ بالماصة.

بعد ذلك، يتم تحضين العينة عند 37 °C لمدة 36 دقيقة. اجمع الرائق الذي يترسب في أنبوب إبندورف. أدخل معلمات الحصول على بيانات EPR: مجال مركزي قدره 34.27 gauss، وسعة تعديل قدرها 6 gauss، وتردد قدره 9.8 GHz.

نظراً لأن المعلمات ستختلف من جهاز إلى آخر ومن ظروف تجريبية إلى أخرى، يرجى مراجعة النص لمعرفة المعلمات الأخرى المستخدمة في هذا الجهاز. انقل السائل الطافي إلى خلية EPR مسطحة وأغلقها بالشمع (paraffin) ثم ضعها في تجويف EPR. سجل الأطياف لمدة 21 دقيقة تقريباً عند 121 مسحة وبمعدل 10.4 ثانية لكل مسحة بعد تشغيل التجربة.

استخدم برنامج brucker WIN EPR لمعالجة البيانات لتصحيح الخط القاعدي وتكامل الأطياف ثنائية الأبعاد (2D spectra)، مما يقلل من ضوضاء الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أن وقت المسح وعدد عمليات المسح قد يختلفان من تجربة إلى أخرى. كما يمكن أن تختلف طرق تصحيح الخط القاعدي من برنامج إلى آخر.

لبدء فك ارتباط Enos، قم بإزالة الوسط من البئر الثانية في صفيحة الستة آبار، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 mL من DPBS. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول Syn one المُحضّر بتركيز 0.5 mM، وأكمل الحجم إلى 2 mL باستخدام DPBS المحتوي على 10% FBS. قم بتحضين الخلايا لمدة ساعتين عند 37 °C و5% CO2، وبعد التحضين.

اغسل الخلايا باستخدام DPBS مرتين. ثم أضف 210 µL من كبريتات الحديد سباعية الهيدرات بتركيز 2.8 mM المحضرة حديثاً، و 210 µL من MGD بتركيز 19.6 mM المحضر حديثاً وفقاً للإجراء السابق. بعد ذلك، أضف 4.6 µL من أيون الكالسيوم بتركيز 1.9 mM، وامزج المحلول مرة أخرى.

كما في السابق، قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة. وبعد مرور 36 دقيقة، اجمع المادة الطافية التي تترسب في أنبوب إبندورف وانقلها إلى خلية EPR مسطحة. سجل أطياف EPR باستخدام نفس معلمات الاستحواذ السابقة بعد عملية الاستحواذ.

عالج البيانات بنفس الطريقة قبل بدء هذا البروتوكول. قم بتحضير محلول مخزون من DMPO بتركيز 1 molar وPBS يحتوي على 0.1 millimolar من DTPA. ثم قم بتحضير محلول بتركيز 1 mg/mL من 4 by 12.

قم بإعداد حصص مقدار كل منها 1 mL من المحلول المخزون لـ PMA (Myristoyl palmitoyl-N-acetyl-S-serine) في DMSO عن طريق تخفيفه ليصل تركيزه إلى 10 µg/mL في محلول PBS داخل أنبوب Eppendorf يحتوي على 1 mg/mL من D-glucose و 1 mg/mL من الألبومين. قم بتحضير تركيز يتراوح بين 5 إلى 6 ملايين خلية PMN لكل mL عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة في أنبوب Eppendorf سعة 1.5 mL. قم بتحضير خليط بحجم نهائي قدره 60 µL يحتوي على ما يقرب من 1.6 × 10⁶ من خلايا PMN و 10 mM من DMPO و 0.2 µg/mL من PMA.

في هذه التجربة، سنستخدم مطياف Bruker ESP 300 X band. انقل المحلول إلى خلية EPR مسطحة، ثم ضع الخلية المسطحة في تجويف EPR. أدخل معاملات الحصول على بيانات EPR: المجال المركزي 3, 486 goss، وسعة التعديل 0.5 goss، والتردد 9.8 gigahertz.

نظراً لأن المعلمات ستختلف من جهاز إلى آخر ومن ظروف تجريبية إلى أخرى، يرجى مراجعة النص لمعرفة المعلمات الأخرى المستخدمة في هذه التجربة لجمع الأطياف. في هذا العرض التوضيحي، نبين الكشف عن أكسيد النيتريك وجذور البيروكسيد SU باستخدام مصيدتين دورانيتين مختلفتين، وهما iron MGD و DNPO.

نوضح أن تحفيز الخلايا البطانية بـ calcium ion four ينتج أكسيد النيتريك، وأن المعالجة بـ seen one، وهو مانح لـ perine nitrite، يمكن أن تقلل من إنتاج أكسيد النيتريك. ومع ذلك، فإن تحفيز الخلايا المتعادلة باستخدام PMA في وجود مصيدة سبين النيترو ينتج جذراً هيدروكسيلياً ADDA بدلاً من S oxide وذلك بسبب عدم استقرار superoxide adda المتكون في البداية. وبينما تظل آليات اصطياد السبين بواسطة iron mg d nitros متماثلة بشكل أساسي، فإن إضافة أكسيد النيتريك إلى iron MGD تتضمن pass rate of reaction، كما أن شكل iron MGD nitric oxide add يكون مستقراً للغاية.

وفي الواقع، يمكن تجميد المحلول عند -80 °C للحصول على طيف EPR لاحقاً دون حدوث انخفاض ملحوظ في شدة إشارة EPR. ومن ناحية أخرى، فإن الكشف عن الأكسيد باستخدام مصيدة الغزل النيتروجينية يكون بطيئاً، مما يتطلب تركيزات أعلى من مصيدة الغزل مقارنة بما هو عليه الحال في استخدام MGD 4 الحديدي للكشف عن أكسيد النيتريك.

تم استخدام عدة منهجيات للكشف بنجاح عن شكل ناتج إضافة السوبر أكسيد، وهو ما لم نعد نوضحه في هذا الفيديو. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يؤدي استخدام الخلية المسطحة إلى الحصول على شدة إشارة أعلى لناتج إضافة السوبر أكسيد نظراً لزيادة كثافة الخلايا. أشجعكم على الرجوع إلى النص لمزيد من التفاصيل حول هذا الأمر.

علاوة على ذلك، وبدلاً من استخدام DMPO، يمكن استخدام مصيدة سبين معتمدة مثل BMPO و VMP أو Nitro DAP MPO المفسفر، والتي يمكن أن تعطي نواتج إضافة لبيروكسيد SU أكثر استدامة. كما استُخدم السيكلوديكسترين لتحقيق استقرار نواتج إضافة بيروكسيد SU عند استخدام مصائد السبين للكشف عن US. ويُنصح بشدة بالحصول الفوري على طيف EP بعد توليد سوبر أكسيد SU.

وبناءً على ذلك، يعد الكشف عن أكسيد النيتريك باستخدام MGD الحديدي أكثر كفاءة بكثير، ويتمثل التحدي الرئيسي الذي يواجه الآن اصطياد السوبر أكسيد بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (PR) في تحقيق الخصائص الملحوظة في تكوين MGD الحديدي مع أكسيد النيتريك. أي التفاعلية السريعة مع السوبر أكسيد وتكوين نواتج إضافة مستقرة؛ لذا تُبذل حالياً جهود في مختبرنا وفي مجموعات أخرى لتطوير مصائد سبين ذات تفاعلية سريعة تجاه السوبر أكسيد وتكوين نواتج إضافة مستقرة.