الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مجموعات الميكروبات المشفرة على مستوى الجينوم لفهم تفاعلات الأدوية الجينات والبيئة الجينية بطريقة متوازية للغاية. يتم تحقيق ذلك من خلال فحص مجموعة الميكروبات لخمسة إلى 20 جيلا من النمو في وجود دواء يستخدم الروبوتات للحفاظ على الخلايا في النمو الأسي. كخطوة ثانية ، يتم جمع الخلايا ، مما يسمح لنا باستخراج الحمض النووي الجيني من 4 ، 000 إلى 6 ، 000 فرد في وقت واحد.

يتم تحديد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية التي تشتمل على الرموز الشريطية المضخمة باستخدام تهجين المصفوفات الدقيقة أو تسلسل الباركود من أجل تحديد الرموز الشريطية ، وبالتالي تحديد وفرة كل سلالة في مجموعة معقدة. في النهاية ، يتم الحصول على النتائج التي تظهر أن الطفرات المشفرة حساسة للعلاجات وبالتالي يتم استنفادها من المسبح أثناء التجربة. الميزة الرئيسية للتقنية التي سنراها اليوم هي أنه بدلا من التعامل مع السلالات بشكل فردي كمستعمرات على صفائح أو ثقافة سائلة فردية هنا ، يمكننا سحب عشرات أو مئات الآلاف من السلالات المختلفة وتحليلها كمجموعة واحدة.

لذلك بمجرد أن أدركنا قوة هذا الاختبار ، احتجنا إلى أتمتته ، ولحسن الحظ ، كنت أعمل في مستشعر Stanford Genome Technology وكنت محاطا بالمهندسين الذين سمحوا لي بتحقيق ذلك ، ويوضح البروتوكول اليوم أندرو سميث ، طالب دراسات عليا كبير في مختبري والذي سيسير عبر جميع البروتوكولات والإجراءات المرتبطة بها ، وكذلك تانيا دوريك ، التي ستوضح لنا كيفية القيام بجوانب التسلسل للبروتوكول. يستخدم هذا البروتوكول مكتبة من طفرات البيض الكندية التي تم إنشاؤها بواسطة التبديل على الطفرات ، حيث يحمل كل طفرة علامة باركود لدمج الطفرات الفردية في تجمع واحد. يتم نسخ نسخة من المكتبة على 3 84.

صفائح الآبار التي تحتوي على edia المستعمرات عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تصل إلى الحد الأقصى للحجم. ثم العمل في بيئة علم الأحياء الدقيقة مع اللهب والمعقم ، قم بإغراق كل صينية بخمسة إلى 10 ملليلتر من الوسائط وانقعها لمدة خمس دقائق. قم بتعليق المستعمرات باستخدام موزع خلية وصب الخلايا السائلة الزائدة في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل.

أضف DMSO إلى 7٪ اضبط الخلايا على تركيز OD 600 نهائي يبلغ 50 لكل مليلتر مع وسائط تحتوي على 7٪ DMSO ثم كميات كميات 40 ميكرولتر في أنابيب شريط PCR ، ويمكن تخزين حصص الخلايا المجمعة إلى أجل غير مسمى عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لبدء هذا الإجراء ، قم بإذابة ذوبان الحصص الخلوية المجمعة على الجليد ، وقم بتخفيف المسبح على الفور برفق في الوسائط باستخدام دواء أو حالة من اختيارك ، مع تلقيح 600 OD من 0.0625 في حجم إجمالي قدره 700 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 48 بئر. لأغراض هذا الفيديو ، سيتم إعداد ثلاث نسخ من شرطين.

قم بتضمين عنصر تحكم واحد مناسب على الأقل في المذيبات على اللوحة. أغلق اللوحة بختم صفيحة بلاستيكية ، وقم بزراعة الخلايا في مقياس الطيف الضوئي أو شاكر يتم التحكم في درجة حرارته يهتز عند 30 درجة مئوية مع نظام اهتزاز محدد تجريبيا. على سبيل المثال ، رج العبوة لمدة 14 دقيقة ، واقرأ الآبار لمدة دقيقة واحدة ، ثم استأنف الرج.

يمكن للروبوت حصاد جزء من تعليق الخلية وحفظه على صفيحة فحم على السطح الآلي. في النقاط الزمنية للتوليد التي يحددها المستخدم ، عادة 5 و 10 و 15 و 20 جيلا من النمو. حصاد ما لا يقل عن اثنين من الخلايا لكل عينة ونقطة زمنية.

انقل عينات الخلايا المحصودة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا لاستخراج الحمض النووي الجيني ، والذي سيظهر بعد ذلك لبدء هذا الإجراء. الحمض النووي الجيني المنقى من الخلايا التي تم حصادها في نقاط زمنية مختلفة باستخدام مجموعة نجمة الخميرة.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع تعديل واحد [إلوت], الحمض النووي مع 300 ميكرولتر من 0.1 [إكست]. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعلين تفاعلي PCR لكل عينة. واحد لعلامات UPT والآخر للعلامات السفلية.

تحقق من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة على مادة هلامية. من المتوقع أن يكون منتج 60 زوجا أساسيا لكل من أجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل لمكبرات الصوت ، وتستخدم للتهجين كما هو موضح في الممرات الأولى والثالثة. في هذا المثال، من المتوقع الحصول على منتج 130 زوجا أساسيا لأمبليكونات لتسلسل الباركود كما هو موضح في الممرات الخامسة والسابعة.

في هذه المرحلة ، يمكن استخدام منتجات PCR إما لتحليل المصفوفات الدقيقة أو تسلسل الباركود المباشر اعتمادا على منتج PCR الذي تم إنشاؤه. للتحضير لتحليل المصفوفات الدقيقة ، قم بتسخين درجة حرارة فرن التهجين مسبقا إلى 42 درجة مئوية وقم بإعداد حمام مائي مغلي ودلو ثلج يحتوي على ملاط ماء مثلج. قم بترطيب المصفوفات مسبقا عن طريق الملء ببطء ب 120 ميكرولتر من تهجين x واحد. مخزن مؤقت.

احتضان المصفوفات في المخزن المؤقت للتهجين عند 42 درجة مئوية و 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق أثناء احتضان المصفوفات ، وقم بإعداد أنابيب القفل العلوي 0.5 مليلتر مع 120 ميكرولتر من التهجين. امزج لكل عينة بالإضافة إلى عينة إضافية كمخزن مؤقت لكل أنبوب. أضف 30 ميكرولترا من الامتصاص و PCR و 30 ميكرولترا من PCR إلى مزيج التهجين لإجمالي 150 ميكرولترا.

يغلي لمدة دقيقتين ويوضع في الماء المثلج لمدة دقيقتين على الأقل. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة قبل الاستخدام. قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين المسبق من المصفوفات وأضف 120 ميكرولترا من مزيج PCR المهجين لمنع التبخر.

قم بتغطية حشوات المصفوفة ببقعة صلبة ، وقم بالتهجين لمدة 16 ساعة عند 42 درجة مئوية و 20 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المصفوفات من فرن التهجين وإزالة البقع الصلبة من الرقائق. قم بإزالة مزيج التهجين ببطء من المصفوفات بواسطة الماصة واملأ المصفوفات.

مع 120 ميكرولتر من غسل تحميل المصفوفات في غسالة المحطة السائلة المعبأة. سيتم غسل المصفوفات باستخدام بروتوكول الجين Flex SV 3 4 50 مع التعديلات التالية. خطوة إضافية واحدة مع الغسيل A قبل تلطيخها.

اغسل ب ، درجة حرارة 42 درجة مئوية بدلا من 40 درجة مئوية وتلطيخ عند 42 درجة مئوية على محطة السوائل بدلا من 25 درجة مئوية. بعد عمليات السوائل ، قم بتشغيل محطة السوائل ، وأغلق أربعة بروتوكولات 50. قم بتفريغ الغسالة بعد التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.

ضع المصفوفات في الماسح الضوئي وامسح ضوئيا بطول موجة انبعاث يبلغ 560 نانومتر. يتم استخدام منتج PCR المكون من 130 زوجا أساسيا لتسلسل الباركود من الجيل التالي لإنجاز أول عينة منفصلة من الحمض النووي المكون من 12 قطعة على هلام 12٪ من الصفحة. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الجل باللون الأخضر الإلكتروني وقطع شريط الجل المثير للاهتمام.

ثم يتم قياس الحمض النووي المستخرج من الجل عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لإنشاء مجموعات على خلية تدفق قراءة واحدة باستخدام CBOT ومجموعة توليد الكتلة أحادية القراءة. قم بتحميل خلية التدفق في جهاز التسلسل ولاحظ القاعدة الأولى تنزل. جهاز التسلسل الموضح هنا هو مصفوفة تمثيلية البيانات التي تم جمعها في نقاط معينة من البروتوكول.

نمت مجموعة الطفرات الموسومة لمدة 20 جيلا في وجود العامل المضاد للفطريات كلوتريمازول وفي DMSO كسجل تحكم تم حساب نسبتين ورسمها لكل جين. يتم تمييز جميع السلالات الحساسة بشكل كبير لعلاج كلوتريمازول بنسبة لوغاريتم اثنين من اثنين باللون الأحمر. يتم عرض أربع سلالات في هذا المثال ، NCP واحد ERG اثنان وأليلان مستقلان من ERG 11.

يجب التحقق من الهدف البروتيني المعروف للعقار المضاد للفطريات سلالات كلوتريمازول التي تم اكتشافها على أنها حساسة في شاشة مجمعة فيما يتعلق بحساسيتها في فحوصات النمو الفردية في وجود نفس تركيز الدواء. يوضح هذا الرسم البياني التالي نتائج تجربة التأكيد هنا. السلالات الأربع المكتشفة في الشاشة قد انخفضت النمو بالنسبة للسلالة الأم من النوع البري.

BWP 17 مشار إليه باللون الأسود. تسلط منحنيات النمو الفردية هذه الضوء على ميزة مهمة لشاشات الأدوية الجينية المجمعة ، وهي أن الرتبة المطلقة لسلالة معينة لا تعكس بالضرورة مستوى حساسيتها بالضبط. علاوة على ذلك ، تظهر النتائج قيمة وجود أليلات متعددة لكل جين.

في هذه الحالة ، يكون للطفرات الاضطراب ERG 11 حساسيات مختلفة قليلا تجاه الدواء. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمسة أيام من تلقيح الشاشة إلى تحليل البيانات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. لذا في حين أن كل تجربة فردية تكشف بيولوجيا ، فإن القوة الحقيقية تأتي عندما تقوم بالكثير من التجارب وتجمع قاعدة بيانات بحيث تكون قادرا الآن على التنبؤ بوظيفة الجينات وعمل الدواء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مجموعات متحولة مشفرة على مستوى الجينوم لفحص المسبح ، وكذلك كيفية استخدام الأشعة الدقيقة أو التسلسل لتحديد الجينات ذات الأهمية بعد تطويرها. سمحت هذه التقنية للباحثين في مجال علم الجينوم الوظيفي باستكشاف وظيفة كل من الجينات ال 6000 المختلفة في جينوم الخميرة.