وحيد ذبابة الفاكهة Ommatidium تشريح والتصوير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح وتصوير ذبابة Drosophila أو matia مفردة لدراسة الأحداث داخل الخلوية في نماذج التنكس العصبي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فصل رأس الذبابة عن بقية الجسم ثم فتحه.

بعد ذلك، يتم إزالة الدماغ والأنسجة الأخرى من داخل الرأس. ثم يتم إزالة cuticle، ويُقطع كل retina إلى نصفين. وتتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في استئصال O باستخدام إبرة تنجستن وترسيبها على شريحة.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر العضيات البلعومية السيتوبلازمية من خلال مجهر الفلورسنس البؤري. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تحليلاً بيولوجياً خلوياً عالي الدقة في نماذج ذبابة الفاكهة (drosophila) الخاصة بالتنكس العصبي، والتي كانت حتى الآن تقدم رؤى جينية فقط في هذا المجال، مما يثبت أن الإجراء سيكون متغيراً. قام بذلك طالب دراسات عليا من مختبري بمساعدة دانيال ماكاي، وهو فني في علم الأنسجة والمجهر في المركز.

للبدء، املأ بئراً واحدة من شريحة زجاجية ثلاثية الآبار بمحلول ملحي منظم بالفوسفات، ثم خدر الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون. وبمجرد تخدير الذباب، التقط ذبابة واحدة باستخدام الملقط وأسقطها في الطبق الصغير الذي يحتوي على محلول PBS. وتحت مجهر تشريحي، أمسك الخرطوم بالملقط ثم افصل الرأس عن الجسم عن طريق قطع الرقبة.

باستخدام مجموعة ثانية من الملاقط لتثبيت رأس الذبابة من منطقة الخرطوم، اقطع الرأس إلى نصفين على طول الخط الناصف الأنفي الجانبي باستخدام مقص دقيق. ولإظهار الدماغ، استخدم طرف ماصة مقطوعاً لالتقاط الرأس وتثبيت الشبكية ثم انقله إلى بئر أخرى مملوءة بوسط Schneider. قم بإزالة معظم كيوتيكل الرأس باستخدام الملاقط، ثم استخرج الدماغ.

حافظ على الشبكية محصورة بين الصفيحة والقرنية. بعد ذلك، انقل الشبكية إلى قطرة بحجم 50 µL من وسط شنايدر الطازج. ضعها مباشرة على شريحة زجاجية، ثم أمسك إما النهاية الظهرية أو البطنية للشبكية باستخدام ملقط ومقصات دقيقة.

اقطع الشبكية إلى نصفين على طول الخط المتوسط الظهري البطني للكشف عن AMIA في منتصف العين. استمر في الإمساك بالشبكية بحيث تكون القرنية متجهة لأسفل والصفيحة متجهة لأعلى. وباستخدام إبرة تنجستن رفيعة، افصل oia أولاً عن الصفيحة ثم عن القرنية.

ستتجمع أجسام الـ oia الفردية ومجموعات الـ OIA في قاع البئر أو الشريحة. قم بإزالة أي شوائب كبيرة قد تكون تجمعت قبل المتابعة. لتحليل عملية الالتهام الذاتي، قم بتخفيف LysoTracker بنسبة 1 إلى 1000 في قطرة من وسط Schneider، ثم اخلط وانتظر لمدة 10 ثوانٍ.

قم بإزالة السائل الزائد من الشريحة، مع الحرص على ترك الـ AMIA. أضف قطرة من وسيط الحماية (vector shield) لتغطية الـ amia.

ضع غطاءً شريحةً وقم بإغلاقها باستخدام طلاء الأظافر. باستخدام المجهر confocal، يمكن رؤية كل من الجسيمات البلعمية المرمزة بـ g fp a TG eight والجسيمات الحالة المرمزة بـ lyo Tracker في تيديم واحد تم تشريحه من ذبابة تعبر عن شكل طافر من atropin. تعرض لوحة المجال المضيء في أعلى اليمين البنية شبه السليمة للتيديم، ويشير الإطار إلى المنطقة التي تم مسحها. هنا، يشير اللون الأحمر إلى الجسيمات الحالة ويشير اللون الأخضر إلى الجسيم البلعمي الذاتي.

تظهر الأوتوليزوسومات (الجسيمات الحالة الذاتية)، الناتجة عن اندماج العضيتين، باللون الأصفر. وباتباع هذه الإجراءات، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل استزراع المواد وإعطاء الأدوية للإجابة على تساؤلات مختلفة، مثل تحديد المركبات الفعالة في علامات الالتهام الذاتي في الخلايا العصبية ذات الخلفيات الجينية المختلفة.

الجمع بين مزايا علم وراثة ذبابة الفاكهة (drosophila) وبعض التحليلات المتقدمة في بيولوجيا الخلية الممكنة في المزارع الخلوية.