متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

ويقدم لمحة شاملة من التقنيات المستخدمة في توليد نموذج الفأر من سرطان الفم والرصد الكمي لغزو الورم داخل اللسان من خلال متعدد الفوتون المجهري للخلايا المسمى. هذا النظام يمكن أن تكون بمثابة منبرا مفيدا لتقييم نجاعة الأدوية الجزيئية والمضادة للمركبات الغازية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج نموذج فأر لسرطان الفم يسمح بتصور وقياس غزو الورم في اللسان. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد خلايا سرطان حرشفية فموية أولا لتصوير فوتونين عن طريق عدوى العدسات الفيروسية للحياة Act M الكرز والاختيار النسيلي المستقر. بعد ذلك ، يتم إنتاج أورام الطعم الغريب في الفئران العارية عن طريق حقن الخلايا المسماة بالكرز في ألسنة الفئران المخدرة.

ثم يتم تصوير الورم المحتوي على ألسنة بواسطة منظارين مجهريين فوتونيين. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر غزو ورم فموي موضعي كميا داخل عضلة اللسان من خلال تصويرين فوتونيين لأنسجة اللسان الطازجة وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر اللاحقة للأورام الأولية والمجموعات الخلوية التي تم غزوها إقليميا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكيمياء المناعية أو التصوير الحيوي ، هي أنه يمكن قياس غزو الخلايا السرطانية كميا في ثلاثة أبعاد.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التدخل العلاجي سرطان الفم لأنها توفر نظاما نموذجيا لتحليل البروتينات المشاركة في غزو الورم ، بالإضافة إلى تقييم المركبات قبل السريرية على الاستراتيجيات العلاجية المضادة للتوغل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأن حقن الخلايا السرطانية في اللسان وإعداد اللسان لإجراء فحص مجهري ضوئي أمر صعب من الناحية الفنية ، ويتطلب مهارة وممارسة. يعد تصور هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم حقن الورم في خطوتين فوتونية ويتطلب مهارة متخصصة لبدء الثقافة.

خطوط خلايا ورم الرأس والرقبة البشرية في وسط كامل يتكون من DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية. من أجل نقل تسلسل طلاء الكرز LIFE Act M إلى موقع ناقل الفيروسات العدسية PLL 7.0 ، يلزم أولا إدخال ثلاث طفرات صامتة في موقع التعرف على SBF واحد في mCherry CD NA الأصلي. بعد ذلك ، قم بتضخيم تسلسل mCherry لقانون الحياة المعدلة مع مواقع ECO R واحدة SBF واحدة وفرعية في PLL 7.0. لتوليد بناء الكرز PLL 7.0 LIFE Act M بعد ثقافة نظام التعبير الفيروسي ، يلتقي خط خلية التعبئة 2 9 3 T 17 إلى 40٪ في وسط كامل.

باستخدام Cal Foss ، قم بنقل الخلايا باستخدام متجهات PLL 7.0 LIFE Act و M cherry و PS PACS two و P-V-S-V-G بنسبة ثلاثة إلى اثنين إلى واحد على التوالي. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط بوسط جديد وكامل ، واجمع الوسط وتجديده كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة ، وقم بتخزين الوسط الذي تم جمعه عند أربع درجات مئوية لإنتاج خطوط خلايا الرأس والرقبة بعمر مستقر تعبير الكرز Act M. قم بتدوير الوسط الذي تم جمعه عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، وأضف ملليلترا واحدا من الوسط الموضح الذي يحتوي على الفيروس إلى OSC 19 أو US CCC خلية واحدة لمدة 12 ساعة.

اشطف الخلايا ، ثم أضف ملليلترا إضافيا من الفيروس لمدة 12 ساعة أخرى. استزراع الخلايا في وسط يحتوي على 200 ملليغرام لكل مليلتر من الميسين بور لمدة أسبوعين لتحديد مستعمرات مقاومة ، وفحص المستعمرات الباقية بصريا مدى الحياة. فعل m تعبير الكرز عن طريق الفحص المجهري الفلوري عيون التربسين ، المستعمرات الإيجابية الفردية باستخدام أقراص استنساخ معقمة بثلاثة ملليمترات.

الحفاظ على الخلايا الموجبة في وسط يحتوي على 200 ملليغرام لكل مليلتر من pur mycin حتى تتجمد مرة أخرى ، أو تستخدم في الحقن تقويم العظام لتوليد ورم تقويم العظام xenograft tripsin life act. M الكرز الذي يعبر عن الخلايا السرطانية ثم الطرد المركزي للثقافة وإعادة تعليق حوالي 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة في 50 ميكرولتر من الوسط الكامل. قم بتحميل الخلايا السرطانية في حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بإبرة قياس 27 نصف بوصة.

التخدير التالي ، ثعلب رياضي أنثى يبلغ من العمر ثمانية أسابيع. فأر عاري واحد مع مزيج من 80 ملليغرام لكل كيلوغرام من الكيتامين و 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من الزيلازين. بمجرد أن يتوقف عن الحركة ، ضع مرهم تزييت العين وتحقق من الاستجابة عن طريق الضغط على ظفر في وسادة القدم.

حافظ على الفئران على وسادة تسخين بين 37 و 40 درجة مئوية. باستخدام ملقط معقم ، أمسك طرف اللسان برفق واسحبه من تجويف الفم. حقن الخلايا ببطء في جانب واحد من كل لسان لإنشاء كتلة منتفخة في مركز اللسان.

حقن الفئران ب 2.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من اليوهي وإعادتها إلى وسادة التدفئة لمراقبتها أثناء التعافي من التخدير. ضع الفئران في أقفاص معقمة تحتوي على نظام غذائي ناعم معدلة وراثيا. قم بوزن الفئران كل يومين إلى ثلاثة أيام وراقبها بصريا بحثا عن ظهور الورم.

لتحضير ألسنة الفئران للتصوير خارج الجسم الحي ، قم بالقتل الرحيم للفئران التي تؤوي أورام في نقاط زمنية مختلفة. باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون ، استخرج الألسنة واشطفها ب XPBS واحد. ثم باستخدام خيط خياطة أحادي الشعيرات من متجر هوايات محلي وإبرة خياطة مقاس ثمانية.

اربط اللسان بجانب واحد من كاسيت تضمين أنسجة البارافين التقليدية. بمجرد تثبيت اللسان ، اغمر مجموعة الكاسيت بالكامل في XPBS واحد. قم بمعالجة الألسنة على الفور باستخدام منظارين مجهريين فوتونيين لتصوير الألسنة باستخدام منظارين مجهريين فوتونيين.

اغمر أشرطة اللسان في طبق 60 ملم يحتوي على XPBS واحد. قم بتأمين الطبق في حامل تصميم مخصص على ذراع ناتئ قابل للسحب موضوعة تحت هدف مجهر الفوتونين. ضع عدسة موضوعية بفتحة عددية مقاس 40 × 0.8 مباشرة على آفة ورم مرئية أو فوقها.

قم بتصوير اللسان بواسطة اثنين من المجهريات الفوتينية باستخدام ليزر التيتانيوم الياقوت بكثافة 60 مللي واط وطول موجة إدخال يبلغ 755 نانومتر. لتحسين إشارة M cherry ، قم بجمع صور المسح الضوئي بالليزر بميكرومتر واحد على أعماق متزايدة ميكرومتر واحد على عمق إجمالي للأنسجة يتراوح بين 15 و 100 ميكرومتر. باستخدام هذا التكوين ، يمكن تحليل الأورام التي يصل عمق الأنسجة إلى ملليمتر واحد.

استخدم مسح الصورة لالتقاط الصور. تولد صورة المسح إخراج قناتين لأنماط المسح الضوئي للتحكم في مرايا المسح المتري XY galvan وفي نفس الوقت تلتقط إشارة أربع قنوات كحد أقصى مدخلة في وقت واحد من أنابيب مضاعف الصور من خلال لوحة الحصول على البيانات. يجمع مسح الصورة ضوئيا صور مكدس Z عن طريق التحكم في المحور Z للهدف ويجمع صور اللقطات المتتابعة في وضع واحد أو دوري.

احفظ الصور في ملف TIF واحد بعمق 16 بت. باستخدام برنامج Amira ، قم بعرض مكدسات صور الورم في صورة واحدة ثلاثية الأبعاد عن طريق فتح ملف TIF الذي يحتوي على مجموعة صور مكدس Zs. استخدم وظيفة TEX لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد.

المحتمل أن تكون صورة الورم الأولية الكبيرة مع العديد من المجموعات الغازية المنفصلة الأصغر أو igs موجودة في الصورة المعروضة. لقياس حجم الورم ، حدد عتبة منطقة الورم الأولية وكل شريحة من مكدس الصور تصحح وتقضي على مضان الخلفية. كرر إجراء العتبة لكل مجموعة غازية.

بمجرد تحديد الورم الأساسي وجميع igs ، حدد قياس الحجم بالإضافة إلى إحداثيات OID للورم X و Y و Z للورم الأساسي. من أجل حساب مسافات igs من نقطة الورم المركزية ، احسب مؤشر الورم الغازي أو ti باستخدام ti يساوي N NT في VT في dt. حيث يساوي NT العدد الإجمالي ل igs في الصورة ، فإن VT يساوي الحجم الإجمالي لجميع igs و DT يساوي المسافة الإجمالية التي تقطعها جميع المجموعات الغازية من مركز الورم الأساسي.

يمكن إنشاء عروض ثلاثية الأبعاد بتفاصيل طبوغرافية أكبر عن طريق استيراد ملفات الأطراف أحادية اللون الأصلية 16 بت إلى عناصر NIS من نيكون داخل البرنامج. قم بإنشاء ملف ND من مكدس صور. ثم قم بمعايرة المستند يدويا لتحديد حجم البكسل للحصول على عروض عالية الجودة.

أضف شرائح إضافية في المستوى Z. يوضح هذا الشكل مثالا على البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من عنصري NIS أو مرآة لصورة فوتون. يمكن استخدام البرنامج لإعادة بناء البيانات الأولية لأورام اللسان ، وهو ما هو موضح في هذا الشكل.

تعرض هذه اللوحة مثالا على العرض ثلاثي الأبعاد باستخدام وظيفة TEX في برنامج Amira. فيما يلي مثال على عتبة قسم فردي من الفوتون من مكدس الصور لتحديد المجموعات الغازية من الورم الأساسي بالإضافة إلى مركز الورم الأساسي أو الويد. بعد تحليل كل قسم من أقسام العتبة ، تحدد أميرة الحجم والمسافة التي تقطعها كل مجموعة غازية من Centro.

يمكن إظهار هذه البيانات بيانيا واستخدامها للحصول على القيمة الرقمية للمستوى الكامل لغزو الخلايا السرطانية. تعزى إلى الموقع الأساسي الموضح هنا هي صور تمثيلية للأورام كما هو موضح من خلال وضع العلامات على الكيمياء المناعية المرضية التقليدية مقارنة بصورة ثلاثية الأبعاد لورم مماثل باستخدام البروتوكول الموصوف بمجرد إتقانها من نقطة استخراج اللسان إلى العرض ثلاثي الأبعاد النهائي ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء محاولة هذا الإجراء ، احرص على عدم ثقب اللسان بالإبرة ، وبالتالي فقدان الخلايا السرطانية وإعاقة الورم بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء اختبار المركبات العلاجية أو الخلايا ذات مستويات البروتين التي تم التلاعب بها من أجل تحديد فعاليتها في غزو سرطان الفم.

في بيئة في الجسم الحي ، لا تنس أن العمل مع الخلايا السرطانية البشرية المعدلة بفيروس العدسات هو احتياطات خطيرة مثل معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء التدفق الصفحي المعتمد من BSL يجب دائما أن يؤخذ أثناء العمل مع الفئران المحقونة.