متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج فأر لسرطان الفم يسمح بتصوير وقياس غزو الورم في اللسان. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد خلايا سرطان الخلايا الحرشفية الفموية للتصوير ثنائي الفوتون عبر العدوى الفيروسية البطيئة بـ life Act M cherry والانتخاب النسيل المستقر. بعد ذلك، يتم إنتاج أورام طعوم غريبة في الموقع الأصلي في فئران عارية عن طريق حقن الخلايا المسمى بـ life Act M cherry في ألسنة الفئران المخدرة.

بعد ذلك، يتم تصوير الألسنة التي تحتوي على أورام باستخدام مجهر الفوتونين. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر قياساً كمياً لغزو الورم الفموي الموضعي داخل عضلة اللسان من خلال التصوير بالفوتونين لأنسجة اللسان الطازجة، يليه إعادة بناء ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر للأورام الأولية والمجموعات الخلوية التي غزت المنطقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الكيمياء النسيجية المناعية أو التصوير بالتألق الحيوي، في إمكانية قياس غزو الخلايا الورمية كمياً في ثلاثة أبعاد.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو التدخل العلاجي لسرطان الفم لأنها توفر نظاماً نموذجياً لتحليل البروتينات المشاركة في غزو الورم، بالإضافة إلى تقييم المركبات قبل السريرية في استراتيجيات علاجية مضادة للغزو. وبشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه التقنية بعض الصعوبات نظراً لأن حقن الخلايا الورمية في اللسان وتحضير اللسان للمجهر ثنائي الفوتون يتطلبان دقة تقنية عالية، ومهارة وممارسة. ويعد التصوير المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات حقن الورم في المجهر ثنائي الفوتون يصعب تعلمها وتتطلب مهارة متخصصة لبدء المزرعة.

خطوط خلايا أورام الرأس والعنق البشرية في وسط كامل يتكون من DMEM مضاف إليه 10% FBS، و1% penicillin streptomycin، و1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية. من أجل نقل تسلسل طلاء LIFE Act M cherry إلى موقع ناقل PLL 7.0 lentiviral، يلزم أولاً إجراء طفرات موجهة للموقع لإدخال ثلاث طفرات صامتة في موقع التعرف SBF one في mCherry CD NA الأصلي. بعد ذلك، يتم تضخيم تسلسل Life Act mCherry المعدل بواسطة PCR مع مواقع ECO R one SBF one المحيطة، ثم يتم استنساخه فرعياً في PLL 7.0. لإنتاج بناء PLL 7.0 LIFE Act M cherry باتباع نظام تعبير lentiviral، يتم استزراع خط خلايا التغليف 2 9 3 T حتى تصل درجة التلاقي إلى 17-40% في وسط كامل.

استخدم CalFect لتر transfection للخلايا باستخدام ناقلات PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS two و P-V-S-V-G بنسبة 3:2:1 على التوالي. بعد 24 ساعة، استبدل الوسط بوسط كامل وجديد، ثم قم بجمع الوسط وتجديده كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة، واحفظ الوسط المجموع عند درجة حرارة 4 °C لإنتاج خطوط خلايا الرأس والعنق ذات تعبير مستقر لـ life Act M cherry. قم بطرد الوسط المجموع مركزياً بسرعة 2000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم أضف 1 mL من الوسط المصفى الذي يحتوي على الفيروس إلى خلايا OSC 19 أو US CCC one لمدة 12 ساعة.

اغسل الخلايا، ثم أضف ملليلتر واحد إضافي من الفيروس لفترة 12 ساعة أخرى. ازرع الخلايا في وسط يحتوي على 200 mg/mL من pur mycin لمدة أسبوعين لاختيار المستعمرات المقاومة، وافحص المستعمرات الناجية بصرياً للتأكد من حيويتها. تحقق من تعبير m cherry باستخدام المجهر الفلوري، ثم قم بهضم المستعمرات الإيجابية الفردية باستخدام تريبسين وأقراص استنساخ معقمة بقطر 3 mm.

يتم الحفاظ على الخلايا الموجبة في وسط يحتوي على 200 mg/mL من pur mycin حتى يتم تجميدها مرة أخرى، أو استخدامها في الحقن في الموقع الأصلي لإنشاء طعم غريب لورم في الموقع الأصلي trypsin life Act. يتم بعد ذلك طرد الخلايا الورمية التي تعبر عن M cherry مركزياً، ثم إعادة تعليق حوالي 2.5 × 10⁴ من الخلايا في 50 µL من الوسط الكامل. يتم تحميل الخلايا الورمية في سرنجة سعة 1 mL متصلة بإبرة مقاس 27 gauge وطول نصف بوصة.

بعد ذلك، يتم تخدير أنثى فأر من سلالة fox عديمة التيموس (athymic) تبلغ من العمر ثمانية أسابيع. يتم تخدير فأر عارٍ واحد بمزيج من 80 milligrams per kilogram من ketamine و 10 milligrams per kilogram من xylazine. وبمجرد أن يتوقف الحيوان عن الحركة، يتم وضع مرهم لترطيب العين والتحقق من الاستجابة عن طريق الضغط بظفر الإصبع على وسادة القدم.

يُحفظ الفئران على وسادة تدفئة في درجة حرارة تتراوح بين 37 و 40 درجة Celsius. وباستخدام ملقط معقم، يتم الإمساك بطرف اللسان برفق وسحبه خارج تجويف الفم. ثم تُحقن الخلايا ببطء في أحد جانبي كل لسان لتكوين كتلة بصلية في مركز اللسان.

احقن الفئران بـ 2.1 milligrams per kilogram من yohi being وأعدها إلى وسادة التدفئة لمراقبتها أثناء الإفاقة من التخدير. ضع الفئران في أقفاص معقمة تحتوي على نظام غذائي من العجينة المعدلة وراثياً واللينة. زن الفئران كل يومين إلى ثلاثة أيام وراقبها بصرياً لرصد ظهور الأورام.

لتحضير ألسنة الفئران للتصوير خارج الجسم (ex vivo)، يتم قتل الفئران التي تحمل أوراماً في نقاط زمنية مختلفة. باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون، استخرج الألسنة واشطفها بـ 1X PBS. ثم استخدم خيط خياطة أحادي الشعيرة من متجر هوايات محلي وإبرة خياطة مقاس ثمانية.

قم بتثبيت اللسان على أحد جانبي كاسيت تقليدي لطمر الأنسجة في البارافين. وبمجرد تثبيت اللسان، اغمر مجموعة الكاسيت بالكامل في 1X PBS. قم بمعالجة الألسنة فوراً باستخدام مجهر فوتوني ثنائي لتصوير الألسنة باستخدام المجهر الفوتوني الثنائي.

اغمر كاسيتات اللسان في طبق بقطر 60 مليمتر يحتوي على XPBS واحد. قم بتثبيت الطبق في حامل مصمم خصيصاً على ذراع كابولي قابل للسحب وموضع تحت عدسة مجهر الفوتونين. ضع عدسة شيئية غاطسة مائية بفتحة عددية 40 x 0.8 مباشرة على أو فوق آفة ورمية مرئية.

يتم تصوير اللسان باستخدام مجهر الفوتونين (two photon microscopy) بواسطة ليزر التيتانيوم ياقوت (titanium sapphire laser) بكثافة 60 milliwatts وطول موجي مدخل قدره 755 nanometers. ولتحسين إشارة M cherry، يتم جمع صور متسلسلة بمسح ليزري بدقة 1 µm عند أعماق متزايدة بمقدار 1 µm، على عمق نسيجي إجمالي يتراوح بين 15 و 100 µm. وباستخدام هذا الإعداد، يمكن تحليل الأورام التي يصل عمقها النسيجي إلى 1 mm.

استخدم ميزة مسح الصورة (scan image) لالتقاط الصور. يقوم مسح الصورة بتوليد مخرج ثنائي القنوات من أنماط المسح النقطي للتحكم في مرايا المسح الجلفانومترية XY، وفي الوقت ذاته يلتقط إشارة دخل بحد أقصى أربع قنوات بشكل متزامن من أنابيب التضاعف الضوئي عبر لوحة الحصول على البيانات. يقوم مسح الصورة بجمع صور المكدس Z (Z stack) عن طريق التحكم في المحور Z للعدسة الشيئية، كما يجمع صور الفاصل الزمني (time-lapse) في وضع أحادي أو دوري.

احفظ الصور في ملف TIF واحد بعمق 16 بت. وباستخدام برنامج Amira، قم بمعالجة مجموعات صور الورم لتحويلها إلى صورة ثلاثية الأبعاد واحدة عن طريق فتح ملف TIF الذي يحتوي على مجموعة صور Zs stack. استخدم وظيفة TEX لإنشاء تصيير ثلاثي الأبعاد.

من المرجح أن تظهر في الصورة الناتجة صورة لورم أولي كبير مع عدة مجموعات غازية منفصلة (igs) أصغر حجماً. ولقياس حجم الورم، حدد عتبة منطقة الورم الأولي وكل شريحة من مجموعة الصور، مع تصحيح استئصال الفلورة الخلفية والتخلص منها. كرر إجراء تحديد العتبة لكل مجموعة غازية.

بمجرد اختيار الورم الأساسي وجميع المجموعات الغازية (igs)، يتم تحديد قياس الحجم بالإضافة إلى إحداثيات OID للمحاور X و Y و Z للورم الأساسي. ومن أجل حساب مسافات المجموعات الغازية عن نقطة الورم المركزية، يتم حساب مؤشر غزو الورم أو ti باستخدام المعادلة ti = NT × VT × dt. حيث تمثل NT العدد الإجمالي للمجموعات الغازية في الصورة، وتمثل VT الحجم الإجمالي لجميع المجموعات الغازية، بينما تمثل DT المسافة الإجمالية التي قطعتها جميع المجموعات الغازية من مركز الورم الأساسي.

يمكن إنشاء تصورات ثلاثية الأبعاد ذات تفاصيل تضاريسية أكبر عن طريق استيراد ملفات الرأس أحادية اللون الأصلية بدقة 16 bit إلى برنامج Nikon NIS elements. قم بإنشاء ملف ND من مجموعة صور متراكمة (image stack)، ثم قم بمعايرة المستند يدويًا لتحديد حجم البكسل من أجل الحصول على تصورات ذات جودة أعلى.

أضف شرائح إضافية في المستوى Z. يوضح هذا الشكل مثالاً للبيانات الخام التي تم الحصول عليها من صورة ثنائية الفوتون باستخدام NIS elements أو مرآة. يمكن استخدام البرنامج لإعادة بناء البيانات الخام لأورام اللسان، وهو ما يظهر في هذا الشكل.

تعرض هذه اللوحة مثالاً للتصيير ثلاثي الأبعاد باستخدام وظيفة TEX في برنامج Amira. يظهر هنا مثال على تحديد العتبة لمقطع فردي تم الحصول عليه بالتصوير ثنائي الفوتون من مجموعة الصور لتحديد المجموعات الغازية المنفصلة عن الورم الأولي، بالإضافة إلى مركز الورم الأولي أو الـ oid. وبعد تحليل كل مقطع تم تحديد عتبته، يقوم برنامج Amira بقياس حجم كل مجموعة غازية والمسافة التي قطعتها من المركز.

يمكن توضيح هذه البيانات بيانياً واستخدامها للحصول على القيمة العددية للمستوى الكامل لغزو الخلايا الورمية. تُظهر الصور الموضحة هنا للموقع الأولي صوراً تمثيلية للأورام كما تم تصويرها بواسطة وسم الكيمياء النسيجية المناعية المرضية التقليدية، مقارنة بصورة ثلاثية الأبعاد لورم مماثل باستخدام البروتوكول الموصوف. وبمجرد إتقان هذه التقنية، بدءاً من استئصال اللسان وصولاً إلى التصوير ثلاثي الأبعاد النهائي، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين تقريباً إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، يجب توخي الحذر لعدم ثقب اللسان بالإبرة، مما قد يؤدي إلى فقدان الخلايا الورمية وإعاقة أخذ الورم بعد هذا الإجراء. ويمكن إجراء اختبارات للمركبات العلاجية أو الخلايا ذات مستويات البروتين المعدلة من أجل تحديد فعاليتها في غزو سرطان الفم.

في سياق التجارب داخل الجسم الحي، لا تنسَ أن العمل مع الخلايا الورمية البشرية المعدلة بالفيروس البطيء (lentivirus) ينطوي على مخاطر؛ لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل داخل غطاء تدفق صفائحي معتمد من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL 2)، وذلك عند التعامل مع الفئران المحقونة.