تطوير خلية من نوع معين الأبتامرات gp120 المضادة لفيروس الإيدز لتسليم سيرنا

الهدف العام من التجارب التالية هو توليد RNA Aptima مختبرياً لبروتين HIV one GP one 20 باستخدام غشاء النيتروسليلوز. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يليه نسخ T seven مختبري. ولتحضير الحمض النووي DNA الأولي ومكتبة RNA العشوائية كخطوة ثانية، يتم وضع خليط من البروتين المستهدف ومكتبة RNA على مرشح نيتروسليلوز مبلل مسبقاً، مما يسمح بعزل جزيئات RNA المرتبطة عن أنواع RNA غير المرتبطة.

بعد 12 دورة اختيار، يتم استنساخ مكتبة RNA وتسلسلها من أجل تحديد مرشحي الأبتيمر (aptima) الفرديين من المكتبة. وقد تم الحصول على نتائج تحدد عدة أبتيمرات جديدة ذات ألفة نانومولارية بناءً على مقاييس إزاحة الهلام (gel shift assays) والمجهر البؤري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمقاييس الحالية مثل تقنيات الخرزات (beads) أو مقاييس العزل المعتمدة على الأعمدة في بساطتها وعدم حاجتها لمعالجة مسبقة للبروتين أو المكتبات، مثل تثبيت البروتين على الخرزات. وقد تم تحضير مكتبة RNA لعزل أبتيمرات RNA المضادة لـ HIV GP120 من مكتبة DNA مُصنعة تجارياً تحتوي على 50 نيوكليوتيد من التسلسلات العشوائية.

يبلغ طول تسلسل مكتبة قليلة النيوكليوتيد (oligo) للحمض النووي DNA أحادي الخيط 81 نيوكليوتيد. وكما يظهر في هذا المخطط، يحيط بالمنطقة العشوائية منطقتان ثابتتان؛ المنطقة A 30 tumor عند الطرف الخماسي (5 prime)، والمنطقة 16 MA عند الطرف الثلاثي (3 prime). وتشمل المناطق الثابتة محفز T seven للنسخ المختبري، وعلامة ثلاثية (3 prime tag) لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي R-T-P-C-R.

قم بتضخيم مكتبة DNA oligos العشوائية أحادية السلسلة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، مع قصر التفاعل على 10 دورات للحفاظ على وفرة مكتبة DNA الأصلية. بعد تفاعلات PCR، يتم استرداد مجمع DNA مزدوج السلسلة المضخم باستخدام طقم تنقية الهلام (gel purification kit). بعد ذلك، يتم تحويل DNA مزدوج السلسلة إلى مكتبة RNA باستخدام طقم cript وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع استبدال CTP و UTP في خليط تفاعل النسخ بـ two fluoro pyrimidine CTP و two fluoro pyrimidine UTP لإنتاج RNA مقاوم للريبونوكلياز.

عند اكتمال تفاعلات النسخ، قم بهضم التفاعلات باستخدام DS one لإزالة الحمض النووي القالب، ثم قم بالتنقية باستخدام هلام بولي أكريلاميد بنسبة 8% ويوريا بتركيز سبعة مولار. وأخيراً، قم بتحديد كمية مكتبة RNA المنقاة عن طريق UV spectra phyto. وقبل البدء في اختيار optimas، قم بتحضير المحاليل المنظمة المطلوبة وتخزينها في درجات الحرارة المناسبة.

محلول منظم Heaps في درجة حرارة الغرفة، ومحاليل منظم لإعادة طي الحمض النووي الريبوزي (RNA) وربط الحمض النووي الريبوزي (RNA) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قبل البدء في الدورة الأولى من عملية الاختيار، يتم تحضين مجموعة الحمض النووي الريبوزي (RNA) العشوائية على مرشح نيتروسليلوز مبلل مسبقاً في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لتقليل الارتباط غير النوعي بالمرشح. بعد مرور 30 دقيقة، يتم إزالة مرشح النيتروسليلوز.

اجمع بين تجمع الـ RNA العشوائي المُنقى مسبقاً وبروتين HIV one bowel GP one 20 في محلول ربط RNA منخفض الملوحة، ثم حضنهما على منصة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، مرر التفاعل عبر مرشح نيتروسليلوز مبلل مسبقاً واغسله بـ 1 mL من محلول ربط RNA منخفض الملوحة لاستخلاص الـ RNA المرتبط من المرشح. أخرج غشاء النيتروسليلوز من حامل المرشح.

أضف 200 µL من محلول الاستخلاص (elu buffer) إلى الغشاء وسخنه عند 95 °C لمدة خمس دقائق. بعد استخلاص RNA من المرشح، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وانقل محلول RNA إلى أنبوب جديد وأجرِ استخلاصاً بالفينول والكلوروفورم للمادة المستخلصة. استخدم عمود MicroCon YM 30 لتركيز RNA واستخلص RNA المسترد باستخدام 20 µL من الماء الخالي من RNAs.

يتم بعد ذلك نسخ مجمع RNA المسترجع عكسياً، ثم يتم تضخيمه من خلال 15 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وبعد تنقية مجمع السلاسل المزدوجة المُضخم، يتم نسخه إلى مجمع RNA جديد كما تم توضيحه سابقاً قبل جولة الاختيار التالية. قم بإعادة طي مجمع RNA في محلول HBS المنظم بتركيز 1x، ثم سخنه إلى 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق، واتركه بعد ذلك ليبرد ببطء حتى يصل إلى 37 درجة مئوية.

استمر في الحضن عند 37 °C لمدة 10 دقائق. قم بامتزاز الـ RNA المعاد طيه، واسحبه إلى مرشح نيتروسليلوز لمدة 30 دقيقة قبل الحضن مع بروتين HIV bowel GP one 20 المستهدف لجولة الاختيار التالية. ومن أجل الحصول بنجاح على الـ abers ذات ألفة الارتباط الأعلى، يجب التحكم بدقة في صرامة الاختيار من خلال ضبط ظروف الاختيار.

تظهر شروط الاختيار في هذا الجدول. بالنسبة لجولات cellex من الأولى إلى الرابعة، يتم تحضين مجمع RNA المُنقى مسبقاً مع البروتين المستهدف في محلول ربط RNA منخفض الملوحة لمدة 30 دقيقة. بعد الجولة الرابعة من cellex، يتم استخدام محلول ربط RNA عالي الملوحة مع تقدم عمليات cellex.

يتم تقليل كمية بروتين GP120 وزيادة خميرة TRNA المنافسة من أجل زيادة صرامة عملية اختيار الأبتامرات في كل دورة. كما يتمت مراقبة تقدم عملية اختيار أبتامرات HIV-1 GP120 من خلال مقايسة الربط بالمرشح. وفي هذا الفيديو، سيتم تحليل مجموعات RNA الـ 12 التي جُمعت بعد جميع دورات الاختيار.

أولاً، قم بإزالة ثلاثي الفوسفات في النهاية 5' من خلال معالجة كل مجموعة RNA باستخدام calf intestinal phosphatase لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. ولتحضير RNA المعالج بـ CIP للوسم باستخدام T4 polynucleotide kinase و P32 80 p، يتم التسخين عند 95 °C لمدة خمس دقائق، يليه التبريد على الثلج. يُجرى وسم RNA في غرفة ساخنة مخصصة للتجارب التي تتضمن نشاطاً إشعاعياً باستخدام PNK buffer و T4 Polynucleotide kinase و 1 µL من gamma P32 ATP والماء حتى يصل الحجم إلى 20 µL. يتم التحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، أضف 20 µL من الماء إلى كل تفاعل وقم بالتنقية باستخدام عمود G 50. أخيراً، احصل على 40 µL من الـ RNA المسمى بتركيز نهائي يبلغ 250 nM مع إعادة الطي، حيث يتم وضع كل تجمع من الـ RNA المسمى في محلول منظف HBS بتركيز 1x ويُسخن إلى 95 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، اترك المحلول ليبرد حتى يصل إلى 37 °C، وهو ما سيستغرق من 30 إلى 40 دقيقة.

استمر في الحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بمجرد إعادة طي تجمع RNA، قم بإجراء تفاعل ربط بحجم 100 ميكرولتر. اخلط تجمع RNA المسمى طرفياً مع بروتين GP one 20 وفائض مولي بمقدار عشرة أضعاف من TRNA المنافس غير النوعي في محلول ربط RNA عالي الملوحة، مع الحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الـ 30 دقيقة، افصل 50 µL من تفاعل الارتباط باستخدام مرشح نيتروسليلوز مبلل مسبقاً. بعد ذلك، اغسل المرشح بـ 2 mL من منظم الارتباط، ثم احسب النشاط الإشعاعي المتبقي على المرشح باستخدام عداد وميضي متعدد الأغراض كعدد للتحكم في المدخلات. وفي الوقت نفسه، بالنسبة لـ 50 µL المتبقية من تفاعل الارتباط، تم تحليل مقايسة ارتباط تجمع RNA بعد كل دورة اختيار عن طريق مقايسة الارتباط بالمرشح باستخدام TRNA منافس لمراقبة تقدم HIV-1, GP120.

تم حساب أنشطة ارتباط اختيار Optima كنسبة مئوية من الـ RNA المدخل الذي تم الاحتفاظ به على المرشح في شكل معقد بروتيني-RNA كما هو موضح هنا. تظهر مجموعة الـ RNA الأولية فقط 0.1% من الـ RNA المدخل الذي تم الاحتفاظ به على الغشاء. ومع ذلك، بعد تسع جولات من الاختيار، أظهرت مكتبة الـ RNA التاسعة ارتباط 9.72% من الـ RNA المدخل.

على الرغم من إجراء جولات اختيار إضافية، لم يُلاحظ حدوث أي إثراء إضافي، مما يشير إلى الوصول إلى الحد الأقصى من ارتباط تجمع الـ RNA. وتم تأكيد أنشطة الارتباط لتجمعات الـ RNA بشكل أكبر من خلال مقاييس إزاحة الهلام. وتظهر هذه النتائج أن بعض الربيطات ذات خصوصية الارتباط العالية بالبروتين المستهدف قد تم إثراؤها تدريجياً في تجمعات الـ RNA هذه.

في هذا المثال، أظهر مجمع الـ RNA الثاني عشر أعلى نشاط ارتباط، حيث تم الوصول إلى أقصى ارتباط لمجمع الـ RNA بعد الجولة الثانية عشرة من الاختيار؛ لذا تم نسخ مجمع الـ RNA هذا عكسياً إلى CDNA، والذي تم تضخيمه لاحقاً بواسطة PCR. بعد ذلك، تم تنقية ناتج الـ PCR واستنساخه في ناقل استنساخ TA وإجراء التسلسل بعد محاذاة 140 مستنسخاً. وقد تم تحديد ست مجموعات من anti GP one 20 optimas.

توضح هذه الجدولة فقط التسلسلات العشوائية للمناطق الأساسية في Aptima. تحتوي حوالي 40% من النسخ المتطابقة على تسلسل محفوظ. تم اختيار تسلسل ممثل واحد من كل مجموعة لمزيد من التوصيف نظراً لوفرتها النسبية ضمن مجموعاتها من خلال مقايسة إزاحة الحركية في هلام أصلي، وتم حساب ثابت التفكك KD لهذه الألياف الممثلة، على سبيل المثال، A one.

تبلغ قيمة KD الظاهرية لأفضل الـ abers حوالي 52 nanomolar، كما هو موضح هنا. يمكن لهذه الـ abers المختارة أن ترتبط بشكل انتقائي بـ HIV one bowel GP one 20 المستهدف، ولكن ليس ببروتين H-I-V-G-P one 20 CM. وقد استُخدمت خلايا CHO G one 60 التي تعبر بشكل مستقر عن البروتين السكري للغلاف HIV GP one 60 لاختبار ارتباط واستيعاب الـ anti GP one 20 optimas المختارة.

لا تقوم هذه الخلايا بمعالجة GP one 60 إلى GP one 20 و G 41 لأنها تفتقر إلى البروتيازات المشفرة بواسطة gag والمطلوبة لمعالجة الغلاف. ويكشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن الأبتامرات المحددة بـ S3 ترتبط خصيصاً بخلايا CHO GP one 60، وليس بخلايا cho EE الضابطة التي لا تعبر عن GP one 60. علاوة على ذلك، يشير المجهر البؤري لـ Z axis للخلايا الحية في الوقت الفعلي إلى أنه بعد ساعتين من الحضانة، يتم استيعاب الأبتامرات المحددة بـ SI three بشكل انتقائي بواسطة خلايا CHO GP one 60، وليس بواسطة خلايا cho EE الضابطة. ولوحظ أيضاً أن الأبتامرات تجمعت داخل السيتوبلازم، مما يشير إلى أن أبتامر GP one 20 قد يدخل الخلايا عبر عملية الالتقام الخلوي بوساطة المستقلات.

أخيرًا، بعد مشاهدة هذا المقطع المرئي، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام القياسات الميدانية لعزل RNA Abers.