كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

الهدف العام من هذا الإجراء هو تغيير التعبير الجيني في الجهاز العصبي المركزي الجنيني للخلايا العصبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على الإناث الحوامل في الوقت المناسب وإعدادهن للجراحة. ثم يتم الكشف عن قرون الرحم عن طريق عمل شق في البطن.

بمجرد تعرض الأجنة ، يتم حقن الحمض النووي في البطين الجانبي أو البطين الثالث أو الفضاء تحت الشبكية. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تطبيق تيار كهربائي على الجنين من خلال جدار الرحم ، وتوجيه أقطاب المجداف بحيث يتم وضع القطب الموجب فوق الموقع المفضل للتعداد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر انتشار وهجرة وتمايز الأسلاف العصبية في كيلون تيلاين الذي يموت كيلون وشبكية العين من خلال الفحص المجهري المناعي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الأساليب الحالية ، مثل تنكس الفئران المعدلة وراثيا ، هي أنها سريعة ، وتسمح بإجراء دراسات إنتاجية أعلى ولها تكلفة أقل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التطور العصبي ، مثل الجينات التي تنظم السلف العصبي ، وتكاثر الخلايا ، ومواصفات مصير الخلية ، والتمايز العصبي ، وهجرة الخلايا. قد تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم أفضل للمسارات الجينية التي أكدت على العيوب في تطور الجهاز العصبي المركزي ، والتي يؤدي الكثير منها إلى ضعف إدراكي وهي اضطرابات سلوكية لدى البشر تتجاوز فائدتها في فهم تطور الجهاز العصبي المركزي.

يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أجهزة الأعضاء الأخرى مثل الجهاز العصبي المحيطي النامي والقلب والمشيمة. يمكن أيضا تطبيقه لدراسة نماذج الأمراض في الفئران وكذلك الكائنات الحية النموذجية الأخرى مثل الكتاكيت و xip. بشكل عام ، العقبة الأساسية أمام نجاح الأفراد الجدد في هذه التقنية هي العناية ببقاء الجنين أثناء التلاعب بالأجنة وحقنها وثقبها.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما احتجنا إلى وسيلة سريعة للتلاعب بالتعبير الجيني في الجنين ، تيليسفالون وشبكية العين. قمنا بتطوير هذه التقنية في مختبرنا من خلال تعديل التقنية التي وصفها سال في البداية ، ونشرت في مجلة علم الأحياء التنموي في عام 2001. لقد عملنا أيضا مع مختبر تحطم لإنشاء هذا البروتوكول في الdilon النامي أيضا.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات الحقن والتثقيب الكهربائي لأنها تتطلب تلاعبا دقيقا للغاية بالأجنة ويمكن أن تكون مواقع الحقن في بعض الأحيان صغيرة جدا. مثال ، الفضاء تحت الشبكية يوضح الإجراء اليوم هو راجيف ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر شيرمان لبدء تنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية. بعد ذلك ، املأ المحاقن بمحلول ملحي ومحلول جرس مرضع وضعها على وسادة تسخين للتدفئة في منطقة الجراحة.

قم بتعقيم وسادة التدفئة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بتغطيتها بقطعة شاش معقمة أقل من الشاش. اضبط وسادة التسخين على 37 درجة مئوية. ضع في غرفة تخدير صغيرة وتخديره عن طريق توصيل 5٪ من الفلور مع الأكسجين بمعدل لتر واحد في الدقيقة من خلال المرذاذ.

تأكد من جمع عادم الفلور باستخدام نظام الكسح. بمجرد أن يصبح تنفس عميقا ومنتظما ، أخرجه من الغرفة. استخدم قرص أصابع القدم وردود أفعال وميض العين.

لضمان التخدير الكامل. ضع المخدر على بطنه واستخدم أنبوب التنفس الصناعي لتوصيل 2.25٪ من الثلج من الفلور أثناء الجراحة. حقن البوبرينورفين بتركيز 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم تحت الجلد في مؤخرة العنق.

استمر في مراقبة تنفس وضبط تدفق الفلور إذا لزم الأمر. ثم قم بلصق الشريط على صدر المخدر وتحقق مرة أخرى من استجابة التراجع عن طريق الضغط على القدم الخلفية بملقط حاد. باستخدام قطعة قطن معقمة ، وزعي طبقة سميكة من الكريم على البطن مع التأكد من أن الفراء السفلي مغطى بالكامل.

اتركي الكريم لمدة ثلاث دقائق تقريبا وافحصي بشكل متقطع لإزالة الشعر. باستخدام مسحة معقمة ، بلل وسادة شاش معقمة بالماء المعقم وامسح الشعر عن البطن. بعد ذلك ، قم بتعقيم موقع الشق بالكلورهيكسيدين والمزيد من الماء.

جفف البطن بشاش معقم نظيف. كرر هذه الخطوة مع 70٪ من الإيثانول باستخدام شاش قطني معقم طازج. استعد للجراحة عن طريق ارتداء الزي الجراحي لكشف قرون الرحم.

أولا ، حدد موقع ألبا الخطي على أنه الخط الباهت تحت الجلد عند خط الوسط باستخدام الملقط ، اسحب الجلد بعيدا عن جدار البطن وقطع شقا صغيرا مستقيما من منتصف البطن إلى أسفل باستخدام مقص الجلد باستخدام ملقط ومقص منحني. كرر العملية مع الصفاق. أمسك الصفاق بالملقط.

اسحبي بعيدا ثم قطعي شقا كبيرا بما يكفي لسحب الرحم من خلاله. ضع شاشا معقما بشق عمودي صغير فوق الشق وقم بترطيبه بمحلول ملحي معقم دافئ. بعد ذلك ، حرك الملقط في الشق وحدد موقع الرحم الذي يفتح الشق بالملقط.

أمسك الرحم بين الأجنة الأولى والثانية المرئية واسحب جانبي قرون الرحم على الشاش. احسب عدد الأجنة مع ملاحظة أي ارتشاف أو أجنة ذات حجم جسم صغير. من أجل تحضير العدد الصحيح من حقن الحمض النووي ، بلل قرون الرحم بالمحلول الملحي وأعد قرنا الرحميا بعناية إلى البطن.

لكراهية الإبر الجراحية ، استخدم ماصة مسحوبة مع لسان حال متصل لسحب 10 ميكرولتر من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر. محلول الحمض النووي الخالي من السموم الداخلية الذي يحتوي على صبغة الميثيل الخضراء ويطرد الحمض النووي إلى إبرة جراحية. قم بتركيب أول إبرة مملوءة على المناور الدقيق.

قف متصلة بالحاقن بدءا من الجنين الأقرب إلى المبيض. استخدم ملقطا دائريا لقلب الجنين برفق داخل القضيس بحيث يتم وضعه ووجهه للأمام ، مما يسمح بالحقن في لفة ROS إلى الاتجاه الكرسي. استخدام مصدر ضوء الألياف الضوئية لتحديد خط الوسط للدماغ الجنيني.

لاحظ البطينين الجانبيين الكبيرين المحاطين في المناطق المنقارية. امسك الجنين في مكانه باستخدام ملقط منحني وضع الإبرة الجراحية المملوءة فوق الرحم بحيث تكون زاوية الدخول إلى الدماغ حوالي 45 درجة. بحركة سريعة وثابتة ، أدر القرص على المناور الدقيق لإدخال طرف الإبرة عبر جدار الرحم وفي البطين الجانبي للدماغ الجنيني.

بعد ذلك ، اضغط على وسادة القدم الخاصة بالحاقن الصغير. لحقن محلول الحمض النووي ، يمكن تصور الحقن الناجح بسهولة عن طريق نشر صبغة الميثيل الخضراء في جميع أنحاء بطينات الدماغ الجنينية. الآن بعد أن تم حقن الحمض النووي ، اسحب الإبرة ببطء لإزالتها دون التسبب في الكسر.

ضع الجنين المحقون على الشاش المعقم وبلل جيدا بالمحلول الملحي الدافئ. أمسك الرحم بالقطب الموجب لقطب المجداف الموضوع فوق الموقع المطلوب للتعداد. ثم قم بتوصيل خمس نبضات كهربائية مربعة من 40 إلى 50 فولت و 50 مللي ثانية بمعدل نبضة واحدة في الثانية.

قم بتغطية الجنين المحقون والمصنف كهربائيا بشاش مبلل واقي ، ثم استمر في حقن الجنين التالي. عند الانتهاء من الحقن والحقن الكهربائي لجميع الأجنة المرغوبة في قرن الرحم ، ادفعها بعناية إلى تجويف الجسم. قم بإزالة قرن الرحم الثاني لبدء الحقن والتثقيب الكهربائي للأجنة المتبقية.

بمجرد عودة جميع الأجنة إلى داخل الرحم ، أضف ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من المحلول الملحي الدافئ إلى تجويف البطن ، ثم قم بإزالة الشاش من البطن للكشف عن جوانب الصفاق. استخدم خط الحرير الأسود المضفر لخياطة الصفاق عن طريق تثبيت الخط على الصفاق الأقرب إلى القص والمضي قدما في الخياطة بعيدا عن المرساة. تأكد من أن جميع الغرز مشدودة وعدم خياطة أي أعضاء أو جلد أساسي في الصفاق.

قص خط الخياطة المتبقي وتخلص منه. اسحب الجلد مغلقا فوق خط الخياطة باستخدام ملقط باستخدام دبابيس إغلاق الجلد. قم بقص الجلد مع الحرص على عدم تدبيس خط الخياطة تحته أو شد الجلد بإحكام شديد.

بمجرد الانتهاء ، تأكد من إحكام الدبابيس عن طريق الضغط برفق مع أداة الخياطة هنا ، تم تزويد متجه التعبير A-P-C-I-G بالكهرباء في القشرة المخية الحديثة النامية في E 12. مع استمرار تطور القشرة المخية الحديثة ، تتمايز الأسلاف القمية إما إلى أسلاف قاعدية ثانوية أو خلايا عصبية بعد الانقسامية وتستمر في التعبير عن GFP. يمكن بعد ذلك تحليل هذه الخلايا العصبية للتعبير عن العلامات النموذجية للنوع الفرعي العصبي الموضح باللون الأحمر.

في هذا المنظر الفاسد للدماغ الأمامي للجنين الكهربائي في E 12 وتشريحه في E 14 ، يشار إلى الموقع الكهربائي بواسطة مضان epi الأخضر بواسطة E 14. يظهر تعبير GFP في المهاد وقبل المهاد وما تحت المهاد مما يشير إلى أن مناطق LIC المحتضرة قد تم نقلها بنجاح. يحدد مربع لوحة القيادة موقع القسم من خلال منطقة بطينية واحدة.

تظهر نظرة فاحصة على المنطقة البطينية هجرة خلايا GFP خارج منطقة البطين إلى منطقة الوشاح. حيث ستشكل نوى ما تحت المهاد ، يتم أيضا تثقيب شبكية العين الجنينية بسهولة كما هو موضح في هذا القسم الإكليلي من خلال E 16.5 I كهربائيا باستخدام PCIC في E 15.5. هنا ، يكون تراكم الخلايا الإيجابية للكرز الخاص بطبقة الخلايا العصبية الخارجية ولا يظهر في B rrn ثلاث خلايا عقدية موجبة B في طبقة الخلية العقدية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة إذا لم تظهر مضاعفات غير متوقعة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام تقنيات معقمة مناسبة ، ويد ثابتة عند التلاعب بالأجنة ، وتجهيز جميع المواد اللازمة قبل وضع الأنثى الحامل تحت التخدير. باتباع هذا الإجراء ، يمكن السماح للأجنة المضفرة بالكهرباء بالعيش حتى سن البلوغ ، وعند هذه النقطة يمكن إجراء طرق أخرى مثل المقايسات السلوكية والوظيفية للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بكيفية تأثير التلاعب بجينات معينة في الجنين على وظيفة الخلايا العصبية لدى البالغين. منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطوير الجهاز العصبي المركزي لاستكشاف وظيفة الجينات في الجسم الحي في الفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إدخال الحمض النووي الغريب في الأنبوب العصبي الجنيني. على وجه التحديد ، نوضح لك كيفية تحضير الأنثى الحامل للجراحة. كشف الرحم وحقن الحمض النووي والكهارل في الجنين.

لا تنس أن العمل مع الفلور يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتخاذ الاحتياطات مثل نظام الكسح أثناء تنفيذ هذا الإجراء.