Name: التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: تعلم تقنية التصوير الكالسيومي البصري لقياس نشاط العصبونات الشمية في الفص الشمي لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. تكشف هذه الطريقة الأنماط المكانية والزمانية للنشاط العصبي استجابةً للروائح.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نعترف سيلكه Sachse وEisermann بيات في تطوير هذه المنهجية، بابلو Traversa لرسم المخططات كتلة متزايدة وPelz دانييلا لاستخدام التخطيطي في الشكل 1. ونحن ممتنون لSachse سيلكه، Ramdya بافان ورافاييل Rytz للتعليق على المخطوطة. ويدعم ر الجرس قبل بورنغير إنغلهايم دكتوراه زمالة مؤسسة. ويتم تمويل البحوث في مختبر ر بنتون في العام من قبل مجلس البحوث الأوروبي ابتداء المستقلة جرانت الباحث السويسري والمؤسسة الوطنية للعلوم.

<ol><li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+olfactory+systems+in+insects%3A+anatomy+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li>
<li>Masse, N. Y., Turner, G. C., Jefferis, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+information+processing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Olfactory information processing in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 700-713 (2009).</li>
<li>Hansson, B. S., Anton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+morphology+of+the+antennal+lobe%3A+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Function and morphology of the antennal lobe: new developments.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 203-231 (2000).</li>
<li>Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-in-vivo+preparation+for+optical+recording+of+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 61-69 (1997).</li>
<li>Galizia, C. G., Menzel, R., Holldobler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+odor-evoked+glomerular+activity+patterns+in+the+antennal+lobes+of+the+ant+Camponotus+rufipes%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of odor-evoked glomerular activity patterns in the antennal lobes of the ant Camponotus rufipes.</a> Naturwissenschaften. 86, 533-537 (1999).</li>
<li>Okada, K., Kanzaki, R., Kawachi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+voltage-sensitive+dye+imaging+of+an+in+vivo+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed voltage-sensitive dye imaging of an in vivo insect brain.</a> Neurosci. Lett. 209, 197-200 (1996).</li>
<li>Carlsson, M. A., Knusel, P., Verschure, P. F., Hansson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+Ca2%2B+dynamics+of+moth+olfactory+projection+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal Ca2+ dynamics of moth olfactory projection neurones.</a> The European journal of neuroscience. 22, 647-657 (2005).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience+%28Frontiers+in+Neuroscience%29%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience (Frontiers in Neuroscience)</a>. Christensen, T. A. 13, CRC Press. 349-392 (2005).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+quantitative+Ca2%2B+measurements+using+improved+cameleons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 2135-2140 (1999).</li>
<li>Martin, J. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca+signalling+in+the+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of Ca signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2, 275-275 (2007).</li>
<li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> The Journal of Experimental Biology. 213, 4163-4173 (2010).</li>
<li>Yuste, R., Miller, R. B., Holthoff, K., Zhang, S., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapto-pHluorins%3A+chimeras+between+pH-sensitive+mutants+of+green+fluorescent+protein+and+synaptic+vesicle+membrane+proteins+as+reporters+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synapto-pHluorins: chimeras between pH-sensitive mutants of green fluorescent protein and synaptic vesicle membrane proteins as reporters of neurotransmitter release.</a> Methods Enzymol. 327, 522-546 (2000).</li>
<li>Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+in+Drosophila+pheromone+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity in Drosophila pheromone perception.</a> Trends Neurosci. 30, 512-519 (2007).</li>
<li>Elliott, D. A., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+%3A+a+versatile+system+for+the+expression+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system : a versatile system for the expression of genes.</a> Methods Mol. Biol. 420, 79-95 (2008).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9, 703-709 (2006).</li>
<li>Yagi, R., Mayer, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+LexA+transactivators+and+their+use+in+combination+with+the+Drosophila+Gal4+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Refined LexA transactivators and their use in combination with the Drosophila Gal4 system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16166-16171 (2010).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+System%3A+A+Repressible+Binary+System+for+Transgene+Expression%2C+Lineage+Tracing%2C+and+Mosaic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q System: A Repressible Binary System for Transgene Expression, Lineage Tracing, and Mosaic Analysis.</a> Cell. 141, 536-548 (2010).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
<li>Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+expressed+cameleon+in+Drosophila+melanogaster+is+used+to+visualize+olfactory+information+in+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically expressed cameleon in Drosophila melanogaster is used to visualize olfactory information in projection neurons.</a> Curr. Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li>
<li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li>
<li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+%28Drosophila+melanogaster+Or22a%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo (Drosophila melanogaster Or22a).</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li>
<li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
<li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li>
<li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li>
<li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Functional+characterization+of+Drosophila+melanogaster+Olfactory+Receptor+Neurons%22">Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons</a>. , Freien Universitat Berlin. (2005).</li>
<li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li>
<li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Brain+Imaging%3A+Fluorescence+or+Bioluminescence%2C+Which+to+Choose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li>
<li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويمكن استخدام أساليب إعداد وتحليل وصفها هنا لتحليل رائحة استجابات في أية مجموعة من السكان من الخلايا العصبية في الفص antennal (OSNs، LN والسندات الإذنية) التي يكون التحوير سائق المطابق هو متاح. في حين وصفنا تطبيقه باستخدام مجهر مضان يمكن، على قدم المساواة التصوير الضوئي من هذا الإعداد يتم تنفيذها باستخدام متحد البؤر المجهري أو اثنين من الفوتون، 22،32. في الواقع، وهذه الصكوك الأخيرة التخفيف من مشكلة ضوء تشتت واسع المجال المجهري، والتي يمكن أن تقلل من قرار من الصور، وخصوصا عندما أعداد كبيرة من الخلايا العصبية صريحة الصحفي. هذا الإعداد يسمح عادة تسجيلات لاستجابات رائحة أثار لمدة ساعة على الأقل نصف السنة، ولكن هذه المرة يمكن أن تكون أطول بكثير أو أقل اعتمادا على عدد وطول القياسات سجلت، في الوقت التعرض المستخدمة في كل لقطة والفاصل الزمني بين التحفيز. وعلاوة على ذلك، يمكن للثنائي الفوتون إثارة خفض photobleaching من مندوب فلوريorter، فضلا عن الضيائية الخلوية، للسماح لقياس مدى فترات زمنية أطول 22،32. بغض النظر عن اختيار المجهر، الحركة من الدماغ ذبابة داخل كبسولة الرأس من أكثر المشاكل المتكررة عند التصوير في حيوانات سليمة. في حين تصحيح حركة يمكن تصحيح القضايا البسيطة (الخطوة 5.1)، وهي عادة ما تكون أفضل فقط لتسجيل من الاستعدادات درجة عالية من الاستقرار. استراتيجيات للحد من الآثار حركة ما يلي: (ط) يقيد بشكل صحيح خرطوم الفيل من الذبابة مع العمود الفقري صبار، (الثاني) شل حركة الساقين الذبابة عن طريق تحديد لهم على خشبة المسرح مع eicosane (قبل الخطوة 2.6) (يمكن ذاب eicosane في ~ 37 درجة مئوية، واستخدام سلك من الفضة لتوسيع وصقل غيض من حديد لحام لهذا الغرض)، (الثالث) الخدش المريء (وضوحا بين الأعصاب antennal) مع ملاقط غرامة. بالإضافة إلى G-CaMP1.6 المستخدمة هنا، وعدد من إصدارات محسنة من G-المخيم والكالسيوم مؤشرات أخرى متاحة،والتي تختلف في نسبة إشارة إلى الضجيج بهم، مضان خط الأساس وديناميات الزمنية 12،28،33. وينبغي اختيار دقيق للاستشعار تأخذ في الاعتبار كل من هذه الخصائص، ليتم تحليلها في نوع من الخلايا العصبية، ويجري تناول هذه المسألة البيولوجية. أجهزة الاستشعار الحالية عن التغييرات الكالسيوم التي ترتبط بشكل جيد مع إمكانات عمل 12،34، وتحسينها، إلى جانب الأعداد المتزايدة من خطوط محددة سائق الجينية 35 ستواصل تعزيز إمكانات التصوير الضوئي من النشاط العصبي في الذبابة سليمة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> المزود </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> صبار العمود الفقري </td><td> حديقة مركز </td><td></td><td> ~ رقيقة طويلة 7MM، وليس مرنا جدا </td></tr><tr><td> روزبن </td><td> سلسلة صك متجر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> اثنان عنصر السيليكون </td><td> WPI </td><td> كويك سيل </td><td></td></tr><tr><td> قدمت كتلة شبكي مخصص تصاعد </td><td> متاح من المخططات <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">ove_mountingblock_blueprint http://neuro.uni-konstanz.de/j /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> النحاس الشبكات </td><td> أثينا الشبكات </td><td> G220-5 </td><td> تستخدم عادة لعينات المجهر الإلكتروني. </td></tr><tr><td> مسامير </td><td> أجهزة تخزين </TD&gt; <td></td><td> 2 مم القطر </td></tr><tr><td> البلاستيك coverslips </td><td> بلانو-EM </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 مم </td></tr><tr><td> نصائح لحام الحديد </td><td> كونراد إلكترونيات </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> ينظم امدادات الطاقة </td><td> كونراد إلكترونيات </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> رقيقة الأسلاك </td><td> Isabellenhütte </td><td> عيسى أوم </td><td> 0،013 ملم </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> سيغما </td><td> 21،927-4 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر </td><td> زييس </td><td> D1 Axioexaminer </td><td></td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> شراء البرمجيات </td></tr><tr><td> مستوحد اللون </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> كسر شفرات </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> حامل لشفرة </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> الياقوت شفرة </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> فوز مزدوج شفرة 1MM </td></tr><tr><td> مضخات غشاء الغاز </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 خذيه لل </td><td></td></tr><tr><td> الياقوت شفرة حائز </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> ثلاثة الطريقة صمام </td><td> شركة لي </td><td> LFAA1200118H </td><td> تهيئة البريد </td></tr><tr><td> قياس دوار 500 مل / دقيقة </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> قياس دوار 5 لتر / دقيقة </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> شمع العسل </td><td> Siladent تكنيك </td><td> 209212 </td><td>؛ </td></tr><tr><td> السليلوز وسادة </td><td> Kettenbach الطبية </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> ملاقيط </td><td> بلانو-EM </td><td> T5130 </td><td> دومون البيولوجيا # 5 </td></tr><tr><td> المحاقن </td><td> دينار بحريني </td><td> 300928 </td><td> 2ml، Discardit الثاني، 2pieces </td></tr><tr><td> الإبر </td><td> براون Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب antennal

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

الفص antennal هو المركز الرئيسي الشم في المخ الحشرات، وتمثل ما يعادل التشريحية والوظيفية لمبة وشمي الفقاريات 1-5. تبث معلومات حاسة الشم في العالم الخارجي من اجل الفص antennal بواسطة الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSNs)، والذي فصل في مناطق مختلفة من neuropil تسمى كبيبات وفقا لمستقبلات حاسة الشم الخاصة التي تعبر عنها. هنا، يمكن نظام التشبيك المفتوح المحاور المشبك مع كل من interneurons المحلي (LNS)، الذي يعصب الكبيبات عمليات مختلفة وكثيرة، والخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية)، والتي تنقل المعلومات الشمية إلى أعلى مناطق الدماغ حاسة الشم. بصري التصوير لنشاط LNS، OSNs والسندات الإذنية في الفص antennal - باستخدام المؤشرات الكالسيوم تقليديا الاصطناعية (مثل الأخضر الكالسيوم، FURA-2) أو الجهد حساسة الأصباغ (مثل RH414) - منذ فترة طويلة وهي تقنية مهمة لفهم كيفية حاسة الشم وتتمثل الحوافز والأنماط المكانية والزمانيةالنشاط الكبيبي في العديد من أنواع الحشرات 6-10. تطوير وراثيا ترميز للصحفيين النشاط العصبي، مثل مؤشرات الكالسيوم فلوري G-كامب 11،12 و Cameleon 13، ومؤشر الكالسيوم bioluminescent GFP-aequorin 14،15، أو مراسلا لانتقال متشابك، جعلت synapto-pHluorin ال 16 نظام حاسة الشم لذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يمكن الوصول إليها بشكل خاص للتصوير العصبي، وتكملة لها على نحو شامل، ووصف الخصائص الجزيئية، والكهربية وتشريحي عصبي 2،4،17. ويمكن للصحفيين وأعرب هؤلاء عن طريق انتقائي ثنائي أنظمة التحكم النسخي (على سبيل المثال GAL4/UAS 18، به lexa / LexAop 19،20، نظام س 21) في تعريف السكان من الخلايا العصبية داخل الدوائر حاسة الشم لتشريح مع ارتفاع القرار المكانية والزمانية كيف رائحة أثار ويمثل النشاط العصبي، والتضمين، وتحولت 22-24 &lt;/ سوب&gt;. نحن هنا وصف الطرق إعداد وتحليل لقياس رائحة استجابات في الفص ذبابة الفاكهة antennal باستخدام G-كامب 25-27. إعداد الحيوان مينيملي ويمكن تكييفها لالتصوير باستخدام نطاق ومجال المجاهر مضان، مبائر واثنين من الفوتون.

وصفنا تقنية أنشئت لقياس وتحليل رائحة استجابات الكالسيوم في الفص antennal المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt;.

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

يُعد الفص الهوائي المركز الشمي الرئيسي في دماغ الحشرة، وهو يمثل المكافئ التشريحي والوظيفي للبصلة الشمية لدى الفقاريات...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النشاط الفسيولوجي للعصبونات الشمية في ذبابة الدروزوفيلا (drosophila) والفص الهوائي عن طريق التصوير الضوئي لتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تجميع حامل السلك الخاص بكتلة التثبيت ودرع الهوائي. بعد ذلك، يتم تثبيت ذبابة تعبر عن مستشعر الكالسيوم الفلوري GCaMP وتثبيتها على الكتلة.بمجرد تثبيت الذبابة، يتم قطع القشيرة الموجودة أعلى رأس الذبابة للكشف عن فصوص الهوائيات. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في وضع الذبابة تحت المجهر وتحفيزها برائحة ما. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر أنماط النشاط المستحث بالرائحة في فصوص الهوائيات DLA من خلال تسجيل التغيرات في الفلورة النسبية لمستشعر الكالسيوم G camp.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الكشف عن كيفية تمثيل الروائح كأنماط مكانية وزمانية للنشاط العصبي على مستويات مختلفة من الدوائر الشمية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الأخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية في قدرتنا على تسجيل نشاط عصبونات محددة وراثياً لا يمكن الوصول إليها بواسطة أقطاب التسجيل. وبالرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول المعالجة العصبية للروائح.يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على مناطق أخرى من دماغ الذبابة، مثل الأنظمة السمعية والشمية. أولاً، قم بتمرير البراغي عبر الجزء الخلفي من كتلة التثبيت المصنوعة من البليكسي جلاس، بحيث لا تبرز من الجهة الأمامية. استخدم مثقاباً دقيقاً لعمل تجويف في الحافة العلوية للغرفة الدائرية الخاصة بالذبابة عن طريق الحفر تحت السطح لتقليل سمك الكتلة.باستخدام مجهر تشريحي، اقطع شبكة نحاسية بمشرط بشكل عمودي وبالقرب من الجزء السفلي من الشق لإنشاء طوق لتثبيت الذبابة. تأكد من أن القلابتين الناتجتين في مستوى واحد لأن ذلك سيسهل عملية إدخال الذبابة. وباستخدام عود أسنان، ضع قطرة صغيرة من الغراء السريع على كتلة التثبيت فوق الغرفة الدائرية.بالنسبة للذبابة، ضع الشبكة النحاسية فوق الغراء وثبتها بحيث يكون الشق متمركزاً على الكتلة. اضغط بلطف على الشبكة وأزل أي غراء زائد باستخدام ملقط. أضف قطرات صغيرة من الغراء تحت الأطراف على كل جانب واطوِ الشبكة فوق مقدمة الكتلة بحيث يكون الشق موجهاً مباشرةً إلى الأسفل.تأكد من أن الجزء العلوي من الشبكة بمستوى الكتلة واتركها حتى تجف تماماً. ولصنع حامل سلك، اقطع غطاء شريحة بلاستيكية إلى نصفين وأزل قطعة مركزية لتكوين شكل حرف U. استخدم شمع النحل لإلصاق قطعة من السلك عبر الجزء العلوي من حرف U بحيث لا يكون السلك مشدوداً للغاية.قم بتصنيع درع للهوائي عن طريق استخدام خرامة ورق لعمل ثقب في غطاء شريحة بلاستيكي. قص حواف غطاء الشريحة لتصبح 0.5 في 0.7 سنتيمتر. ألصق غطاء الشريحة البلاستيكي المثقوب على شريط لاصق، ثم ضع قطرة من ethanol على الشريط اللاصق الظاهر من خلال الثقب.لإزالة المادة اللاصقة، قم بتخدير ذباب يتراوح عمره من أسبوع إلى ثلاثة أسابيع من النمط الجيني المناسب عن طريق تبريده على الثلج. وباستخدام مجهر التشريح، التقط ذبابة من مفصل الجناح ومرر سطحها الظهري أولاً على الشبكة النحاسية بحيث تظل معلقة من الرقبة. وإذا لزم الأمر، قم بتدوير الذبابة حتى يكون وجهها متجهاً للأسفل.ضع شوكة صبار رفيعة أمام رأس الذبابة لمنعها من الهروب، وثبت الشوكة أمام الخرطوم لمنعه من الحركة. قم بتثبيت شوكة الصبار على الكتلة باستخدام شمع النحل، مع التأكد من أن أعلى الرأس في مستوى سطح الكتلة. ثبت رأس الذبابة على الكتلة باستخدام قطرة صغيرة من الراتنج المذاب في الإيثانول.ضع الكتلة في صندوق رطب واترك الراتنج يتصلب لمدة ساعة تقريبًا. وباستخدام الملقط، اسحب صفيحة قرن الاستشعار للأمام وأسقط حامل السلك في الطية القشيرية بين قرن الاستشعار والرأس. ثبّت الحامل في مقدمة الكتلة باستخدام المزيد من شمع النحل.باستخدام البراغي المدمجة في الكتلة، ادفع حامل السلك للأمام برفق لإيجاد مساحة بين لوحة الهوائي والرأس. ضع واقي الهوائي فوق رأس الذبابة مع ضمان توسط الوضعية. ثبّت الواقي في الجزء العلوي من كتلة التثبيت باستخدام شمع النحل.باستخدام مقسم شفرة، اصنع ثقباً صغيراً في الشريط الموجود على الدرع، لكشف كيوتيكل رأس الذبابة خلف قرن الاستشعار. يجب ألا يمتد الثقب إلى ما بعد العينين لمنع تسرب العينة. قم بسد الثقب بين الشريط والكيوتيكل باستخدام سيليكون ثنائي المكونات.أزِل أي سيليكون زائد من أعلى رأس الذبابة. ضع قطرة من محلول رينجر الملحي لذبابة الفاكهة (drosophila ringer saline) على رأس الذبابة، مع التأكد من عدم وجود تسريبات وبقاء قرون الاستشعار جافة تماماً. وباستخدام شفرة ياقوتية، قم بعمل خدش خفيف على طول الطية الجلدية خلف قرن الاستشعار مباشرة.بعد ذلك، قم بالقص على طول العينين وعبر السرج في الخلف. وأخيراً، اطوِ قطعة الجلد فوق الحافة المخدوشة وقص من الجانب السفلي. ولتجنب قطع أعصاب قرن الاستشعار، قم بإزالة الغدد والقصبات الهوائية بعناية باستخدام ملاقط دقيقة.اشطف بشكل متكرر باستخدام محلول رينجر لذبابة الفاكهة (Drosophila ringer solution)، مع ترك قطرة كبيرة على الرأس. أدخل وسادة من السليلوز في محقنة بلاستيكية سعة 2 ml باستخدام ملقط نظيف. وباستخدام رأس ماصة مزود بمرشح، ضع 20 µL من المادة العطرية المخففة.قم بسد وإغلاق المحقنة بالغطاء حتى يحين وقت التصوير. ضع قاعدة التثبيت التي تحتوي على الذبابة تحت المجهر. اخفض العدسة الشيئية حتى تلامس محلول رينجر الموجود على رأس الذبابة.عند النظر عبر العينة باستخدام الإضاءة الساطعة (brightfield)، قم بوضع التحضير بحيث تكون الفتحة الموجودة في كبسولة الرأس في المركز وتكون حدودها واضحة وفي نطاق التركيز. انتقل إلى الإضاءة الفلورية واضبط التركيز حتى تتمكن من رؤية العصبونات الموصومة، والتي يجب أن تكون ظاهرة من خلال الفلورة الخضراء الأساسية لـ GCaMP. قم بالتقاط الصور باستخدام كاميرا CCD مثبتة على المجهر باستخدام برنامج الالتقاط المناسب، ثم حدد بؤرة التركيز على الكبيبات (glomeruli) المستهدفة.تأكد من إغلاق الحجاب الحاجز في مسار ضوء الإضاءة لتقييد ضوء الإثارة في منطقة التصوير. ضع مخرج مقياس الشم على بُعد 0.5 سنتيمتر تقريباً أمام قرون استشعار الذباب. تظهر هنا الفصص الشرجية في ذبابة تعبر عن GCaMP 1.6 تحت تحكم محفز عصب حسي شمّي يدفع التعبير في عدة كبيبات؛ حيث يؤدي التحفيز باستخدام 1% من حمض البروبيونيك إلى زيادة في فلورية GAMP، مما يشير إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا في العصبونات الحسية الشمية التي تغذي الكبيبات DC four و DP one L. وتظهر هنا الديناميكيات الزمنية لاستجابات الكالسيوم في الكبيبات DC four و DP one L تجاه حمض البروبيونيك.تُظهر الخطوط السوداء الوسيط لمتوسط delta F over F ضمن المنطقة المستهدفة عبر ثمانية حيوانات، ويشير السطح الرمادي إلى المدى بين الربيعين الأول والثالث للتوزيع. وتوضح الخرائط الحرارية أدناه استجابات الحيوانات الفردية. كما تشير المربعات الأرجوانية المظللة بالأخضر إلى الإطارات التي تم حساب متوسطها لتحديد ذروة استجابات الكبيبات فوق مستويات تألق GCaMP الأساسية، وهي معروضة هنا بشكل كمي.يمكن أن يكون لتصحيح بهتان المراسل الفلوري تأثيرات على الاستجابة. يمكن تصحيح بيانات العينة القصوى في اللوحة اليسرى دون حدوث تغييرات كبيرة في شكل الاستجابة. أما بيانات العينة في اللوحة اليمنى، فهي متأثرة بشدة بتصحيح البهتان، ويرجع ذلك على الأرجح إلى انخفاض الإشارة وبقائها دون خط الأساس بعد انتهاء تحفيز الرائحة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 30 دقيقة تقريبًا.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على جفاف قرون الاستشعار تماماً، وإلا فلن تكون قادرة على اكتشاف الروائح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الصورة وتحليل الرائحة.تحفيز النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة.

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يمكن أن يكون مشروطا النحل في نموذج التعلم الشمية مشهي (PER تكييف). استخدام الروائح والمحفزات ، أنشأنا طريقة السلوك التي يتم تسجيلها في حين يستخدم التصوير في وقت واحد لقياس النشاط الكالسيوم أثارت رائحة الجسم في الخلايا العصبية...

الكالسيوم في الجسم الحي 2 + -- التصوير من الخلايا العصبية بالجسم فطر خلال التعلم الشم في عسل النحل

يصف هذا الفيديو تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة باستخدام GCaMP. يوضح مقطع البروتوكول المميز كيفية تسجيل التغييرات في مضان GCaMP من الخلايا العصبية لجسم الفطر أثناء تجربة تكييف حاسة الشم.

ذبابة الفاكهة في الجسم الحي تصوير الكالسيوم: طريقة للتصوير الوظيفي للنشاط العصبي

يوضح هذا الفيديو طريقة للكشف عن استجابات الخلايا العصبية الحسية في ذبابة الفاكهة باستخدام ربط الترابط والتصوير الفلوري. ترتبط الروابط بمستقبلات الخلايا العصبية ، مما يتسبب في تدفق الكالسيوم. يرتبط الكالسيوم بمجمعات المؤشر ، مما يؤدي إلى انبعاث التألق ، مما يؤكد الاستجابة العصبية للترابط.

الكشف عن الاستجابات الفسيولوجية من الخلايا العصبية الحسية في ذبابة الفاكهة

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في الذباب. يحدد خطوات تحضير الذباب للفحص المجهري ، وإجراء التكييف الشمي ، وتصور تدفق الكالسيوم الناجم عن الرائحة.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم باستخدام مستشعرات الكالسيوم الموضعية بشكل متشابك في ذبابة الفاكهة السوداء

المصدر: Ishimoto, H. }et. al.،، تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لتصور استجابات الدماغ لإشارات الغدد الصماء في ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2018) } يوضح هذا الفيديو تصوير الكالسيوم للدراسةذبابة الفاكهة  استجابات الدماغ للببتيدات العصبية. تكشف الخلايا العصبية التي تعبر عن مؤشر الكالسيوم الفلوري عن ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا والاستجابات الوظيفية لجزيئات الإشارات.

تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي لدراسة استجابات ذبابة الفاكهة للدماغ للببتيدات العصبية

تحتوي الأرجل الأمامية والخرطوم ذبابة الفاكهة على ذخيرة غنية من الخلايا العصبية الحسية الذوقية. هنا ، نقدم طريقة باستخدام تصوير الكالسيوم لقياس الاستجابات الفسيولوجية من الخلايا العصبية الحسية في مقدمة الساق ورطوم الذباب الحي عند التطبيق الخارجي للفرمون الذوقي.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

نقدم هنا البروتوكول الذي يمكن تصوره قبل و/أو الكالسيوم بعد المتشابك في سياق التعلم والذاكرة دروفيفيا . في صور الكالسيوم المجرية باستخدام حساسات الكالسيوم المترجمة بالمشبك يتم الجمع بينها وبين النموذج الكلاسيكي لتكييف حاسة الشم بحيث يمكن تحديد اللدونة المتشابكة الكامنة وراء هذا النوع من التعلم النقابي.

في فيفو البصرية الكالسيوم التصوير من اللدونة متشابك الناجمة عن التعلم في دروفوميلا ميلغاستر

يتيح نهج تصوير الكالسيوم تسجيل الاستجابات التي يسببها الذوق في أدمغة الذباب المستيقظ أثناء تطبيق محلول على الملصق. تستخدم الاستجابات الذوقية الأولية في ذبابة الفاكهة السوداء كمثال ، ولكن يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة الخلايا العصبية النهائية أو الأنواع الأخرى.

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم للاستجابات العصبية الناجمة عن التذوق في ذبابة الفاكهة البالغة

من العوائق الكبيرة لدراسة النشاط الخلوي أثناء العمليات المعرفية مثل التعلم والذاكرة استخدام التخدير لإعداد التصوير في الجسم الحي . يضعف التخدير الذاكرة والإدراك على المدى القصير في نماذج متعددة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تقدم هذه الدراسة طريقة فريدة لتحضير ذبابة الفاكهة للبالغين للتصوير في الجسم الحي بدون تخدير.

في الجسم الحي تصوير النشاط العصبي في ذبابة الفاكهة البالغة غير المخدرة

نقدم بروتوكولات تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية الشمية لليرقات ذبابة الفاكهة ، باستخدام مادة لاصقة للأنسجة الموضعية لتثبيت الحركة. تعزز هذه الطريقة الاستقرار ، مما يسهل التجارب الموثوقة في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. تحلل نصوص R المخصصة إشارات الكالسيوم ، مما يوفر منصة فعالة للبحث الفيزيولوجي العصبي التفصيلي.

تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لخلية عصبية الدائرة الشمية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء الطورية الثالثة

تعلم تقنية التصوير الكالسيومي البصري لقياس نشاط العصبونات الشمية في الفص الشمي لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. تكشف هذه الطريقة الأنماط المكانية والزمانية للنشاط العصبي استجابةً للروائح.

التصوير الكالسيوم من الردود، رائحة أثار في ذبابة الفاكهة لوب Antennal

استكشف المزيد من الفيديوهات