نموذج القرنية الخنازير خارج الجسم الحي لالتهاب القرنية الجرثومي: تقنية لإثبات العدوى البكتيرية في الخلايا الظهارية للقرنية

في عين الفقاريات ، تصاب القرنية - الغطاء الواقي الخارجي - ب Pseudomonas aeruginosa ، مما يؤدي إلى حالة التهاب القرنية - التهاب القرنية.

لإنشاء نموذج التهاب القرنية خارج الجسم الحي ، ضع زر القرنية في عين الخنازير في طبق بتري. يتكون هذا الجزء من الأنسجة من القرنية المحاطة ببقايا الصلبة - غطاء العين الليفي. استكمل طبق بتري بوسائط تحتوي على المضادات الحيوية للقضاء على الميكروبات الملوثة من سطح ظهارة القرنية.

حدد موقع الجزء المركزي من القرنية. قم بعمل شقوق أفقية ورأسية سطحية في النمط المطلوب تخترق الطبقة الظهارية الخارجية للقرنية. انقل الأنسجة المقطوعة ، بحيث يكون جانب القرنية لأسفل ، إلى قالب مجوف متخصص.

املأ تجويف القرنية بالأجار المسال واتركه يتصلب ، مما يقيد الأنسجة داخل القالب. اقلب القالب لفضح السطح المصاب لظهارة القرنية. ماصة Pseudomonas معلقة في المناطق المحفورة من القرنية. تراكب القالب بمزيد من وسط النمو للحصول على نمو بكتيري مثالي. استكمل طبق الثقافة بالوسائط واحتضنها.

تجتاز البكتيريا الشق الظهاري لغزو السدى. داخل السدى ، تسبب البكتيريا تسلل الخلايا المناعية والبروتينات والسوائل في القرنية مما يؤدي إلى استجابة التهابية. يزيد تراكم السوائل من عتامة القرنية ، مما يؤكد التهاب القرنية الجرثومي.

قم بإزالة الوسائط من طبق بتري ، واشطف القرنيات مرتين باستخدام ملليلتر واحد من PBS المعقم. امسك القرنية بالملقط واضغط برفق. استخدم مشرط 10A لعمل أربع قطع - اثنتان رأسيتان واثنتان أفقيتان - في القسم المركزي من زر الصلبة القرنية عبر الطبقة الظهارية إلى السدى الأساسي.

ضع قالبا زجاجيا معقما في طبق من ستة آبار مع الجزء العريض لأعلى. ثم ضع القرنية في منتصف القالب الزجاجي ، بحيث يكون جانب الظهارة متجها لأسفل ، والجزء المصاب من القرنية في القالب الزجاجي.

املأ القالب الزجاجي بالكامل بإضافة مليلتر واحد من محلول الأجار. بعد السماح للأجار بالتماسك ، اقلب القالب الزجاجي بحيث تكون ظهارة القرنية متجهة لأعلى.

يجب إغلاق القالب الزجاجي بأجار حتى أسنانه لمنع تسرب اللقاح أو محلول الدواء.

ماصة 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية مباشرة في منطقة مقطوعة. أيضا ، لكل تجربة ، قم بإعداد عنصر تحكم عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBS المعقم إلى قرنية واحدة ، بدلا من إضافة الثقافة البكتيرية.

بعد ذلك ، أضف 185 ميكرولترا من PBS إلى الجزء العلوي من كل قرنية للحفاظ على رطوبة الظهارة. ثم أضف ملليلتر واحد من DMEM بدون مضادات حيوية إلى قاع كل بئر. احتضان الصفيحة المكونة من ستة آبار عند 37 درجة مئوية مع الرطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى 24 ساعة.

تخلص من DMEM من اللوحة المكونة من ستة آبار وأضف ملليلترا واحدا من PBS المعقم إلى كل بئر لشطفه. قم بإزالة PBS برفق ، دون لمس الجزء المركزي من زر الصلبة القرنية. قم بإزالة القالب الزجاجي باستخدام ملقط معقم ، وضعه في 5٪ Distel. اشطف الجزء العلوي من زر الصلبة البديلة برفق مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS.

استخدم ملقطا رفيع الرأس لرفع حافة زر الصلبة القرنية ، وافصله عن الأجار تحته ، وانقله إلى أنبوب سعة 50 مليلتر مملوء بواحد إلى ملليلترين من PBS المثلج. للمساعدة في فصل البكتيريا عن ظهارة القرنية ومنطقة القطع ، أضف PBS إلى الأنبوب واستخدم الخالط ذو الطرف الدقيق لقص الجزء العلوي من القرنية المصابة. لا يجب تسييل الأنسجة بالكامل.

دوامة لتعليق البكتيريا المستقرة ، وإضافة 20 ميكرولترا من القرنية المتجانسة إلى 180 ميكرولترا من PBS. بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية للتجانس في صفيحة 96 بئرا.

ماصة 10 ميكرولتر من الجانس المخفف على صفيحة أجار الدم.

بعد احتضان اللوحة لمدة 16 ساعة ، احسب عدد وحدات تشكيل المستعمرة.