نموذج رئة الخنزير خارج الجسم الحي للأغشية الحيوية: تقنية لتطوير نموذج الرئة لدراسة الأغشية الحيوية البكتيرية على أنسجة القصبات الهوائية للخنازير

القصيبات هي المسالك الهوائية الأنبوبية للرئتين. أثناء العدوى المزمنة ، تنسد القصيبات بسبب تراكم المخاط. يوفر المخاط الغني بالمغذيات بيئة مناسبة لنمو البكتيريا الانتهازية. يتم تضمين هذه البكتيريا في مصفوفة بوليمرية خارج الخلية منتجة ذاتيا وتتكاثر لتشكيل غشاء حيوي.

لتقليد تطور الأغشية الحيوية البكتيرية على الرئتين ، خذ عينة من أنسجة قصبات الخنزير في طبق بتري. قم بتشريح الأنسجة إلى قطع بالشكل المطلوب. أضف وسائط ثقافة الأغشية الحيوية إلى طبق بتري. عقم الطبق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لإزالة أي ملوثات سطحية.

انقل قطع الأنسجة المعقمة إلى صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط زراعة الأغشية الحيوية ومنصات الاغاروز ، والتي تعمل كركيزة مثالية للالتصاق البكتيري. بعد ذلك ، قم بوخز طرف إبرة يحتوي على مستعمرة من البكتيريا المرغوبة على كل قطعة من الأنسجة لإدخال بكتيريا العوالق في الأنسجة. أغلق اللوحة بغشاء مسامي معقم بالأشعة فوق البنفسجية يسهل تبادل الأكسجين المنتظم في جميع أنحاء سطح اللوحة. احتضان اللوحة المختومة.

أثناء الحضانة ، تلتصق البكتيريا بشكل لا رجعة فيه بالسطح الظهاري من خلال بيلي وتبدأ في إفراز المصفوفة خارج الخلية. داخل المصفوفة ، تستخدم البكتيريا مصادر الطاقة والميوسين والحمض النووي الحر من وسط الثقافة لتشكيل أغشية حيوية. نموذج الأغشية الحيوية البكتيرية جاهز لمزيد من الاختبارات.

ضع القصيبات في أول غسول DMEM / RPMI 1640. اتركه في الغسيل ، واحصد أقساما إضافية من القصيبات من نفس الرئة للحصول على أقسام أنسجة كافية للتجربة المخطط لها. ضع أي أقسام إضافية للقصبات الهوائية من نفس الرئة في الغسيل ، واتركها في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل.

قم بإزالة القصيبات من الغسيل الأول وضع العينات في طبق بتري معقم. برفق ، امسك كل قصيبات بملقط معقم ، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة المتبقية ، وقم بتقطيع الأنسجة إلى شرائح بعرض خمسة ملليمترات باستخدام مقص تشريح معقم.

ضع جميع شرائط أنسجة القصبات الهوائية في غسول DMEM/RPMI 1640 الثاني. اتركيهم في الغسيل لمدة دقيقتين على الأقل. بعد ذلك ، قم بإزالة شرائط المناديل من الغسيل الثاني باستخدام ملقط معقم ، وضعها في طبق بتري نظيف ومعقم. قم بإزالة أي أنسجة رخوة متبقية متصلة بالقصيبات ، وقم بتقطيع الشرائط إلى مربعات باستخدام مقص تشريح معقم.

أضف غسول DMEM / RPMI 1640 الثالث في طبق بتري ، واخلط قطع المناديل برفق في الغسيل عن طريق تحريك الطبق. صب الغسيل الثالث من طبق بتري دون إزالة قطع المناديل.

بعد ذلك ، أضف غسول SCFM النهائي ، مع التأكد من تغطية جميع قطع المناديل. تعقيم الأنسجة في SCFM تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. استخدم ملقطا معقما لنقل كل قطعة من أنسجة القصبات الهوائية المعقمة إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئرا تحتوي على ضمادات الاغاروز SCFM.

لإصابة كل قطعة من الأنسجة بالسلالة البكتيرية المرغوبة ، المس مستعمرة نمت على صفيحة أجار بطرف إبرة قياس 29 متصلة بحقنة أنسولين معقمة سعة 0.5 ملليلتر. ثم المس المستعمرة على قطعة الأنسجة ، وخز السطح برفق. بالنسبة للعناصر المراقبة غير المصابة ، قم بوخز سطح قطعة الأنسجة برفق بطرف الإبرة.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لإضافة 500 ميكرولتر من SCFM إلى كل بئر. عقم غشاء مانع للتسرب قابل للتنفس لكل صفيحة ذات 24 بئرا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الغطاء من اللوحة التي تحتوي على 24 بئرا ، واستبدله بالغشاء القابل للتنفس. ثم احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.