دراسة السن التي تعتمد على عدم الاستقرار الجيني باستخدام س. خميرة يفسبن الزمني النموذجي

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة عدم الاستقرار الجيني المعتمد على العمر في الخميرة من خلال الجمع بين العمر الزمني مع مجموعة من فحوصات تلف الحمض النووي والطفرات البسيطة. يتم تحقيق ذلك عن طريق أخذ عينات أولا من ثقافات الشيخوخة الزمنية كل يومين والتحقق من الجدوى عن طريق وحدة تشكيل المستعمرة أو تشكيل CFU. تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في فحص طفرات الحمض النووي عن طريق أخذ عينات من مزارع الشيخوخة وخلايا الطلاء على وسيط اختيار خاص بالطفرة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في طفرات الحمض النووي أثناء الشيخوخة الزمنية للخميرة من خلال تطبيع نتائج فحص الطفرات إلى الجدوى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال الشيخوخة ، مثل الآليات التي تربط الشيخوخة وعدم الاستقرار الجيني في الأغنية لفحص العمر الزمني للخميرة أو CLS أولا تلقيح مستعمرة خميرة واحدة في مليلتر واحد من الجلوكوز الكامل الاصطناعي ، أو وسط SDC واحتضانه طوال الليل مع الاهتزاز عند 30 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بتخفيف المزرعة الليلية إلى 10 ملليلتر من وسط SDC الطازج إلى OD 600 من 0.05 إلى 0.1 تحتضن مع الرج عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

في اليوم الثالث ، عندما تكون الخلايا في مرحلة ثابتة ، قم بتخفيف كل Eloqua 10 ، 000 مرة في ماء الأوتوكلاف ، ثم قم بإزالة حصتين من 10 ميكرولتر من القارورة ولوحة 10 ميكرولتر من كل مزرعة مخففة على لوحة A-Y-E-P-D. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية حتى تنشأ المستعمرات. يعتبر عدد المستعمرات الناشئة أو وحدات تشكيل المستعمرة من اليوم الثالث 100٪البقاء على قيد الحياة.

استمر في إزالة الحصص من ثقافة الشيخوخة في الأيام اللاحقة للطلاء. ضبط عوامل التخفيف وفقا لذلك لضمان حوالي 20 إلى 100 مستعمرة في فحص CFU. يتم إيقاف أخذ العينات عندما تنخفض صلاحية الثقافة إلى أقل من 1٪ عادة بين اليومين 11 و 13 ، ويمكن أيضا دراسة صلاحية الخلية في الخلايا التي يبلغ عمرها على اللوحات.

لبدء هذا الفحص ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة في مليلتر واحد من وسط الجلوكوز الكامل الاصطناعي ، واحتضانه طوال الليل مع الاهتزاز عند 30 درجة مئوية. عندما تنمو الثقافة إلى حوالي 10 إلى ثماني خلايا لكل مليلتر ، قم بتخفيف المزرعة بماء الأوتوكلاف إلى 100 إلى 200 خلية لكل 10 ميكرولتر و 1000 خلية لكل 10 ميكرولترات. لكل سلالة ، قم بإعداد مجموعة من ثمانية إلى 20 لوحة SDC متسربة من التريتوفان مصنفة وفقا لكثافة الطلاء.

لضمان إمكانية حساب 10 إلى 100 مستعمرة تحسبا لانخفاض الجدوى أثناء الشيخوخة ، قطعتان من 10 إلى 30 ميكرولتر من الثقافة المخففة على كل لوحة. احتضان اللوحة التي تم ضبطها عند 30 درجة مئوية طوال مدة تحليل العمر الافتراضي في يوم الطلاء وكل يومين بعد ذلك ، قم بإزالة صفيحة واحدة وأضف 0.5 مل من الترتوفان للسماح للخلايا القابلة للحياة بالنمو. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة إضافية.

بعد 48 إلى 72 ساعة. عد CFU للجدوى ليوم طبعة التربتوفان لفحص أربعة تلف الحمض النووي وتكرار الطفرة أثناء الشيخوخة الزمنية. يزرع عدد من الأشياء الغريبة ذات الميزات الخاصة بالتوازي مع سلالة النوع البري لمقايسة الخميرة CLS.

يمكن تقييم تردد الطفرة التلقائية عن طريق قياس تواتر مقاومة الرياح في ثقافة الشيخوخة ترتيبا زمنيا. الطفرات في الجين الواحد الذي يشفر نفاذية الأرجينين في البلازما يجعل الخلايا مقاومة للأرجينين التناظرية L Canavan سوف تنمو الخلايا المقاومة للأرجينين على تسرب الأرجينين صفائح متوسطة كاملة اصطناعية مكملة بقياس كبريتات L Canavan لتكرار الارتداد الإيجابي للرحلة في سلالة تحتوي على طفرة كهرمانية في الرحلة. يسمح تسلسل طلاء واحد بتقدير معدل استبدال القاعدة أثناء رحلة الشيخوخة الزمنية للخميرة.

ستنمو خلايا الارتداد الإيجابية على ألواح تسرب التربتوفان. السلالة السالبة ليز EH one 50 تؤوي نوبة زائد أربعة في إطار القراءة المفتوح ، مما يؤدي إلى ضمور الثور لليسين ، ويمكن عكس ذلك عن طريق طفرات الإدخال أو الحذف الصغيرة. سيتم اختيار العكسات على لوحات تسرب اللايسين للكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات الإجمالية أو gcr.

يتم استخدام سلالة متحولة حيث يقع HX T 13 على بعد 7.5 كيلو قاعدة تيلوميريك إلى يمكن أن يتعطل واحد على الكروموسوم الخامس بواسطة طفرات كاسيت U ثلاثة في كل من الجينات الواحدة و U ثلاثة تجعل الخلايا مقاومة ل L Canavan وخمسة حمض أوروتيك فلوري على التوالي. نظرا لأن تواتر الطفرات النقطية التي تحدث في كلا الجيلين منخفض ، فإن تحليل تواتر المقاومة لكل من El Canavan و خمسة حمض فلورو أوروتيك يوفر تقديرا ل gcr لمراقبة مستوى إعادة التركيب المتماثل والمتماثل. أثناء الشيخوخة الزمنية ، يتم إنشاء طفرات تحمل إما تكرارات مقلوبة متجانسة بنسبة 100٪ أو 91٪ متماثلة.

مصلحة الضرائب في إعادة تركيب الموضع الثلاثة بين مصلحة الضرائب يسمح التعبير عن البروتين الثلاثة الوظيفي. لذلك ، فإن الخلايا التي حدث فيها إعادة التركيب ستنمو على صفائح تسرب الهيستيدين المكملة بالجالاكتوز. في اليوم الثالث ، عندما تكون الخلايا في مرحلة ثابتة وسيتم إزالة كمية مناسبة من الخلايا من كل ثقافة شيخوخة.

نظرا لاستخدام نفس الإجراء لجميع المقايسات ، سيتم معالجة عينة واحدة فقط. لغرض هذا الفيديو ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي على الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في مليلتر واحد من حبيبات ماء الأوتوكلاف.

مرة أخرى ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من خلايا لوحة الماء على الألواح المناسبة لاختيار الارتدادات المطلوبة. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية بعد ثلاثة إلى أربعة أيام عد CFUs ، يتم تطبيع تردد الطفرة لعدد الخلايا القابلة للحياة. يوضح هذا الرسم البياني نتائج تمثيلية من مقايسة العمر الزمني النموذجي عند مقارنة البقاء الزمني لخلايا النوع البري ببقاء S CH وتسع دلتا TOR ودلتا واحدة و RAs ، واثنين من طفرات دلتا.

في الاستزراع السائل ، تظهر الطفرات التي تفتقر إلى TOR واحد s أو CH تسعة أو RAs اثنان عمرا زمنيا ممتد. علاوة على ذلك ، تظهر أوجه القصور في s CH nine و RAs two تأثيرا إضافيا على البقاء الزمني لتعزيز طول العمر في وجود مصادر كربون مختلفة. باستخدام NC ، يتم عرض مقايسة الجدوى الثانية في هذا الرسم البياني التالي.

في اليوم الأول ، تم تخفيف الثقافات البرية من النوع البري SDC وطلاءها على ألواح التسرب من رحلة SC بدون مصدر كربون. تم تحضين ألواح التسرب SC Tripp المكملة بألواح الإيثانول الجلوكوز أو الجلسرين عند 30 درجة مئوية كل يومين. تم استرداد صفيحة واحدة من كل مجموعة وتمت إضافة العناصر الغذائية المناسبة للسماح بالنمو وتكوين المستعمرة.

يختلف تواتر الطفرات المعتمدة على العمر اختلافا كبيرا اعتمادا على السلالة والخلفية والتلاعب الجيني والثقافة والظروف والعمر. يوضح هذا الجدول النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في سلالة من النوع البري. تظهر النتائج التمثيلية لتخليق الآفة العابرة في هذه الصورة التالية.

قد تتضمن زيادة تكرار الطفرات المعتمدة على العمر تغييرات في إصلاح الحمض النووي الخاطئ باستخدام المستخلصات النووية وقوالب الحمض النووي المختلفة. يمكننا تقييم توليف الترجمة أو TLS في الخلايا العمرية زمنيا. تم تحليل المستخلصات النووية من المرحلة الثابتة التي يبلغ عمرها ثلاثة أيام ، والنوع البري ، والخلايا الطافرة لتسعة دلتا.

يشار إلى منتجات TLS ذات القالب غير التالف بخطوط صلبة ويشار إلى منتجات TLS ذات القالب التالف بخطوط منقطة. لم يلاحظ تخليق آفة عابرة في المستخلصات النووية من البادئات الخالية من الدلتا الطافرة طويلة العمر s CH التي يشار إليها بالسهم المفتوح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء العمر الزمني وتحليل طفرات الحمض النووي في الخميرة.