موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 5:12 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بإضافة بلازميد كريسبر الكل في واحد إلى الخلايا المناعية الموجودة في الأنبوب. يحتوي هذا البلازميد على جين Cas9 بالاشتراك مع sgRNA أو تسلسل ترميز الحمض النووي الريبي أحادي الدليل ، مكمل للتسلسل المستهدف في جينوم المضيف.
أضف بلازميد متبرع خطي يحتوي على جين معدل وراثي محصور بين أذرع التماثل أو HAs - يتكرر الحمض النووي الضروري لإعادة التركيب المتماثل. قم بإجراء التثقيب الكهربائي ، والذي يستخدم التيار الكهربائي لحقن مزيج البلازميد في الخلية. بمجرد دخوله ، يشكل sgRNA المعالج مركبا مع نوكلياز Cas9 المعبر عنه.
يربط sgRNA الموقع المستهدف ، مما يسمح ل Cas9 nuclease بتحديد تسلسل التعرف المحدد المعروف باسم الشكل المجاور للفاصل الأولي أو PAM ، وشق الحمض النووي المضيف بالقرب منه. يؤدي هذا إلى كسر مزدوج الخيط غير حاد حيث تقوم الآلية الخلوية باستئصال الحمض النووي ، مما يؤدي إلى توليد 3 بوصات متدلية. يؤدي وجود مواقع مرافقة ب HA إلى تشغيل آلية الإصلاح الموجهة بالتماثل حيث ينضم الحمض النووي المقطوع إلى تسلسل HA ، مكونا بنية غير متجانسة مزدوجة - حلقة D.
يستمر تخليق الحمض النووي ، مكونا خيطا مكملا لتسلسل الجينات المعدلة وراثيا حتى ينضم إلى خيط الحمض النووي الأصلي. يعمل الجزء العلوي من الحلقة D كقالب لتجميع الجزء المفقود من الحمض النووي ، مما يولد تقاطعات هوليداي المزدوجة - الهياكل التي تتفاعل فيها أربعة خيوط من الحمض النووي. تحل هذه التقاطعات وتصلح الفجوات ، مما يسهل إدخال الجينات المستهدفة.
قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسط النمو الكامل بدون مضادات حيوية في كل بئر. قم بتسخين اللوحة مسبقا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة 37 درجة 5٪. قم بتشغيل نظام التثقيب الكهربائي. معلمات التثقيب الكهربائي للإدخال لخلايا JURKAT أو RAW.
تحضير خليط الخلية والحمض النووي للتثقيب الكهربائي. اجمع زراعة خلايا JURKAT في قارورة مساحتها 25 سم مربع. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ثم ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 90 × جم لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة.
أما بالنسبة للطافات ، فللغسيل ، قم بتعليق الخلايا باستخدام 5 مل DPBS. بعد ذلك ، قم بتدوير تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي ، باستخدام نفس حالة الخطوة السابقة. قم بإزالة DPBS ، وأعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 2 مل من DPBS. استخدم 10 ميكرولترات من تعليق الخلية ، واخلطها بحجم متساو من 0.2٪ تريبان بلو.
لتقدير عدد الخلايا، قم بتحميل العينة في شريحة الجرد هذه. أدخل شريحة العد في عداد الخلايا الآلي ، واعرض صورة الخلايا ، ثم احصل على نتيجة عدد الخلايا. احسب 2 مليون خلية مقابل 5 تكرارات للتثقيب الكهربائي ، لكل تجربة ضربة.
انقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي. لتوفير الوقت ، يمكن تحضير خليط التثقيب الكهربائي أثناء خطوة الطرد المركزي. أضف 2.5 ميكروغرام من كل ناقل CRISPR-Cas9 ، و 2.4 ميكروغرام من ناقل الاستهداف الخطي ، وإعادة تعليق Buffer R ، إلى الحجم الإجمالي البالغ 55 ميكرولتر ، في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
دوامة برفق ، وتدور لفترة وجيزة حتى تمتزج جيدا. اترك خليط التثقيب الكهربائي في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد الغزل ، قم بسحب جهاز الطرد المركزي DPBS ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية إضافية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. أعد تعليق الخلايا عن طريق إضافة خليط التثقيب الكهربائي المحضر. الماصة لأعلى ولأسفل برفق.
التثقيب الكهربائي: بالنسبة لخليط التثقيب الكهربائي للخلية ، استخدم طرف نوى سعة 10 ميكرولتر مع ماصة.
هام: تجنب فقاعات الهواء أثناء سحب العينات ، فسوف يتسبب ذلك في فشل التثقيب الكهربائي. اضغط على "ابدأ".
بعد التثقيب الكهربائي ، انقل العينة في بئر واحد من ألواح 24 بئرا مع وسط نمو دافئ مسبقا. قم بإجراء نفس إجراءات التثقيب الكهربائي على النحو الوارد أعلاه ، على العينات المتبقية 4 مكررة. هز اللوحة برفق لضمان التوزيع المتساوي للخلايا. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة لمدة 48 إلى 72 ساعة قبل فرز خلايا FACS.