تحرير جينوم كريسبر الكل في واحد: طريقة للإصلاح الجيني الموجه بالتماثل في الخلايا المستنبتة باستخدام نظام CRISPR-Cas9
موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 5:12 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بإضافة بلازميد كريسبر الكل في واحد إلى الخلايا المناعية الموجودة في الأنبوب. يحتوي هذا البلازميد على جين Cas9 بالاشتراك مع sgRNA أو تسلسل ترميز الحمض النووي الريبي أحادي الدليل ، مكمل للتسلسل المستهدف في جينوم المضيف.
أضف بلازميد متبرع خطي يحتوي على جين معدل وراثي محصور بين أذرع التماثل أو HAs - يتكرر الحمض النووي الضروري لإعادة التركيب المتماثل. قم بإجراء التثقيب الكهربائي ، والذي يستخدم التيار الكهربائي لحقن مزيج البلازميد في الخلية. بمجرد دخوله ، يشكل sgRNA المعالج مركبا مع نوكلياز Cas9 المعبر عنه.
يربط sgRNA الموقع المستهدف ، مما يسمح ل Cas9 nuclease بتحديد تسلسل التعرف المحدد المعروف باسم الشكل المجاور للفاصل الأولي أو PAM ، وشق الحمض النووي المضيف بالقرب منه. يؤدي هذا إلى كسر مزدوج الخيط غير حاد حيث تقوم الآلية الخلوية باستئصال الحمض النووي ، مما يؤدي إلى توليد 3 بوصات متدلية. يؤدي وجود مواقع مرافقة ب HA إلى تشغيل آلية الإصلاح الموجهة بالتماثل حيث ينضم الحمض النووي المقطوع إلى تسلسل HA ، مكونا بنية غير متجانسة مزدوجة - حلقة D.
يستمر تخليق الحمض النووي ، مكونا خيطا مكملا لتسلسل الجينات المعدلة وراثيا حتى ينضم إلى خيط الحمض النووي الأصلي. يعمل الجزء العلوي من الحلقة D كقالب لتجميع الجزء المفقود من الحمض النووي ، مما يولد تقاطعات هوليداي المزدوجة - الهياكل التي تتفاعل فيها
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية