تحرير الجينوم القائم على نوكلياز إصبع الزنك: تقنية لتعديل الجينوم في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق آلية إصلاح التماثل المعتمد على التماثل المزدوج

يحتوي نوكلياز إصبع الزنك أو ZFN على مجال ماكرو مرتبط بالحمض النووي مستقر بأيون الزنك متصل بمجال نوكلياز داخلي عبر رابط. يساعد هذا الهيكل في الحفاظ على الخصوصية أثناء قطع الحمض النووي.

لاستخدام ZFNs لتحرير الجينوم ، خذ مزرعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. استكمله ببلازميد يشفر ZFN. أضف بلازميد إصلاح يحتوي على الجين المستهدف وجين مقاومة المضادات الحيوية المحصور بين أذرع التماثل أو HAs. قم بالكهرباء بخليط الخلية والحمض النووي حيث يسهل التيار الكهربائي دخول البلازميدات داخل الخلية.

بمجرد دخولها ، ترتبط زخارف إصبع الزنك الخاصة ب ZFN المترجمة بثلاثة توائم من أزواج القواعد التكميلية في جينوم المضيف ، مما يضع نوكلياز تقييد Fok-1 بشكل صحيح في الموقع المستهدف. ترتبط ZFNs بخيوط متقابلة في أزواج مما يسمح لتجانس Fok-1 بتشكيل مركز تحفيزي نشط يولد فيه Fok-1 فواصل مزدوجة الشريطة من الحمض النووي أو DSBs ، مما ينتج عنه أربعة نيوكليوتيدات.

يوجه وجود HAs في بلازميد الإصلاح الإصلاح المعتمد على التماثل حيث ينقلب الطرف المتدلي ويستخدم تسلسل HA المتماثل كقالب. يستمر تخليق الحمض النووي عن طريق إضافة النيوكليوتيدات المكملة للجين المستهدف.

يتم ربط الفجوات الناتجة ، مما يسهل إدخال الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن جين مقاومة المضادات الحيوية غير المحفز من محفز مضيف في اتجاه المنبع من موقع الإدخال. تنمو الخلايا المعدلة بنجاح في وسط اختيار المضادات الحيوية.

ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في وسائط hESC على صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على الخلايا الليفية الليفية الجنينية للفأر المعطلة بالميتومايسين C ، أو MEF ، الخلايا المغذية المزروعة على الجيلاتين. في كل يوم لاحق بعد الطلاء، حتى يصل hPSC إلى التقاء 50٪، استخدم ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية لإزالة الحجم الكامل للوسائط. استبدل ب 3 ملليلتر من وسائط hESC الدافئة لكل بئر.

قبل يوم واحد من الاستهداف ، قم بإزالة وسائط hESC ، وأضف وسائط hESC جديدة مسخنة مسبقا مكملة ب 10 ميكرومولار Y27632. أيضا ، قم بإعداد واحد إلى لوحين من 6 آبار من خلايا التغذية MEF المقاومة للأدوية من الفئران DR4. في يوم الاستهداف ، قم بإعداد محاليل التعدي عن طريق سحب 5 ميكروغرامات من بلازميد تعبير نوكلياز إصبع الزنك 1 و 2 في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 30 ميكروغراما من بلازميد المتبرع بالإصلاح ، متبوعا بما يكفي من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X ليصل الحجم إلى 300 ميكرولتر. افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من التقاء بنسبة 50٪. بعد ذلك، استخدم ماصة زجاجية ومكنسة كهربائية لإزالة الوسائط من لوحة hPSCs. ثم اغسل الخلايا ب 2 ملليلتر من 1X PBS الدافئ. بعد شفط PBS ، أضف 0.5 مل من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.25٪ مباشرة على الخلايا.

ضعها في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 10 دقائق تقريبا ، أو حتى تبدأ طبقة التغذية في الرفع عن اللوحة. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من وسائط esWash الدافئة إلى كل بئر لإيقاف تفاعل التربسين. اجمع الخلايا من كل بئر ، مع التأكد من أن الخلايا المغذية تخرج على شكل ورقة. قم بعرض محتويات كل بئر في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مليلتر ، يجمع بين جميع الآبار ، ويقوم بتقطيع الخلايا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر.

أضف وسائط esWash ليصل تعليق الخلية إلى 40 ملليلترا. انتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح لقطع التغذية الكبيرة بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، وقم بإيداعها في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا. بعد الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة خمس دقائق عند 190 × جم ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من 1X PBS.

اجمع بين الخلايا المعلقة مع محلول تعداء البلازما المحضر مسبقا. قم بتقطيع الخلايا وخليط التعداء في كوفيت كهربائي 4 ملم ، وضعها على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. اضبط معلمات البرنامج الأسي على نظام التثقيب الكهربائي على 250 فولت ، و 500 ميكرو فاراد ، ومقاومة لا نهائية ، وحجم كوفيت 4 ملم. قم بتغذية الخلايا بالكهرباء ، ثم ضع الكوفيت مرة أخرى على الجليد لمدة ثلاث دقائق.

أعد تعليق الخلايا الكهربائية في 18 مل من وسائط hESC الدافئة المكملة ب 10 ميكرومولار Y27632. افحص DR4 MEFs تحت المجهر. لوحة 3 ملليلتر من التعليق أحادي الخلية في كل بئر من صفيحة 6 آبار تحتوي على خلايا تغذية DR4 ، والعودة إلى الحاضنة. في اليوم الثالث بعد الطلاء ، استبدل الوسائط الموجودة على الخلايا بوسائط hESC بدون Y27632. في اليوم 4 ، استبدل الوسائط غير المكملة بوسائط تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة للاختيار. يستخدم بورومايسين هنا.