التكامل الجيني المستهدف بوساطة TALEN: استخدام نوكليازات هندسية خاصة بالتسلسل من أجل الإدخال الدقيق لجين البروتين الفلوري في hiPSCs
موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 4:24 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بالخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية أو تعليق hiPSC في الوسائط. أضف زوجا من نوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ أو البلازميدات المشفرة TALEN. مكمل مع بلازميد متبرع يحمل جين بروتين فلوري ، إلى جانب جين مقاومة المضادات الحيوية ، مع أذرع تماثل مجاورة لمحاذاة محددة للمواقع المستهدفة.
قم بالكهرباء في الخليط لتوليد مسام عابرة في أغشية الخلايا ، مما يتيح استيعاب البلازميد. بمجرد دخولها الخلايا ، تتم معالجة البلازميدات المشفرة TALEN ، مما ينتج عنه TALENs - بروتينات خيمرية تتكون من مجال ربط الحمض النووي TALE الخاص بالموقع مدمج في مجال انقسام نوكلياز تقييد FokI غير محدد.
يتعرف كل مونومر TALEN عبر مجال ربط الحمض النووي الخاص به - الذي يتألف من وحدات تكرار الأحماض الأمينية الترادفية - ويرتبط بالمواقع المستهدفة ، وحدة واحدة لكل نيوكليوتيد ، على كل خيط DNA في اتجاهات متعارضة ، مفصولة بتسلسل فاصل. ثم تقوم مجالات FokI بتعتيم الحمض النووي وشق الحمض النووي داخل تسلسل الفاصل ، مما يؤدي إلى إنشاء فواصل مزدوجة الخيط مع الأجزاء المتدلية.
في وجود بلازميد متبرع يحتوي على أذرع تماثل مكملة للمناطق المحيطة بالموقع المشقوق ، يحدث الإصلاح الموجه بالتماثل باستخدام التسلسل المتماثل كقالب لتخليق إصلاح الحمض النووي لسد فواصل الخيط المزدوج. بعد ربط النكات ، يتم دمج البروتين الفلوري المتداخل والجينا
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية