Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
phiC31 integrase هو إنزيم إعادة تركيب مشتق من العاثيات يحفز إعادة التركيب الخاص بالموقع للجين المعدل ، وهو جين غريب ، في جينوم المضيف. لتكامل الجينات المعدلة وراثيا في مضيف Anopheles ، ابدأ بجنين Anopheles في مخزن مؤقت مناسب.
تم تصميم جينوم Anopheles مسبقا مع موقع مرفق لتكامل الجينات وعلامة فلورية سماوية للاختيار البصري. بعد ذلك ، أضف حجما صغيرا من البلازميد المتبرع الذي يحمل البضائع الجينات المعدلة وراثيا المطلوب ، وموقع التعلق ، وعلامة فلورية حمراء ، ومكونات العمود الفقري البلازميد إلى قارورة. بعد ذلك ، أضف الحجم الأمثل من البلازميد المساعد الذي يحمل إنتگراز مشفر الجينات. الآن ، قم بتحميل خليط البلازميد في حقنة دقيقة.
قمبحقن البلازميدات برفق في القطب الخلفي للجنين ، وهو موقع منشأ الخلايا الجرثومية ، مما يؤدي إلى حركة طفيفة للسيتوبلازم. بمجرد دخول الجنين ، يبدأ البلازميد المساعد في تصنيع إنزيمات التكامل.
يتوسط إنزيم التكاملات إعادة التركيب الخاص بالموقع بين البلازميد المتبرع والجينوم المضيف. وبالتالي ، فإن الجين المعدل وعلامة الفلورسنت الحمراء من البلازميد المتبرع يندمج داخل مواقع التعلق المؤتلف في جينوم الأنوفيل. بعد ذلك ، احتضان الجنين المحقون في ظل ظروف فسيولوجية للفقس ، مع دوامة متقطعة.
في غضون أيام ، يفقس الجنين في يرق. تحت المجهر الفلوري ، تعبر يرقة الأنوفيليس ذات الجينات المدمجة بنجاح عن كل من التألق السماوي ، وتمييز الجينوم المضيف ، والتألق الأحمر ، مما يشير إلى الجين المعدل من البلازميد المتبرع.
قم بتنقية البلازميدات المانحة والمساعدة باستخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية. اجمع بين البلازميد المتبرع الذي يحمل علامة attB والذي يحمل الجين المعدل محل الاهتمام ، والبلازميد المساعد الذي يحمل الإينتركاز ، للحصول على مزيج بتركيز نهائي يبلغ 350 نانوغرام لكل ميكرولتر من البلازميد المتبرع ، و 150 نانوجرام لكل ميكرولتر من البلازميد المساعد.
قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم من 3 أسيتات الصوديوم المولارية ، في 2.5 حجم من الإيثانول المثلج البارد بنسبة 100٪. ثم دوامة. يجب أن يكون الراسب الأبيض مرئيا على الفور. اغسل الحبيبات, وأعد تعليقها في مخزن مؤقت للحقن, للوصول إلى تركيز نهائي إجمالي يبلغ 500 نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإعداد حصولات من 10 إلى 15 ميكرولترا لكل منها ، وقم بتخزينها عند سالب 20 درجة مئوية.
قم بإطعام البعوض البالغ من العمر 4 إلى 7 أيام من خط الإرساء المطلوب ، ونظرائه من النوع البري ، قبل 72 ساعة من الحقن المجهري. إجراء الحقن المجهري لجنين Anopheles gambiae ، في كلوريد الصوديوم 25 مللي مولار ، من خلال استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 45 درجة.
إجراء الحقن المجهري للأجنة Anopheles stephensi ، في زيت الهالوكربون ، من خلال استهداف القطب الخلفي بزاوية 30 درجة. مباشرة بعد الحقن ، انقل البيض إلى طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم ، وأعده إلى الظروف الحشرية. عند الفقس ، انقل يرقات G0 إلى صينية بها ماء مقطر مملح يوميا ، وخلفها إلى الشرانق.
