إسكات الجينات القائم على التداخل كريسبر: تقنية للقمع المستهدف لوظيفة الجينات في البريميات المسببة للأمراض

يستخدم

تداخل كريسبر أو CRISPRi متغيرا غير نشط من Cas9 ، dCas9 ، لإسكات الجينات المستهدفة ، والتي تثبط وظيفة الجينات.

لإجراء CRISPRi ، استخدم بنية ناقل مكوكي - بلازميد يحتوي على أصول النسخ المتماثل المقابلة لكل من بكتيريا الإشريكية القولونية والبكتيريا Leptospira ، مما يسهل التكاثر في كلا النوعين.

يحتوي

المتجه أيضا على تسلسل خاص بجين dCas9 والحمض النووي الريبي أحادي التوجيه أو sgRNA ، للتعرف على التسلسل المستهدف.

في البداية ، يكون ناقل المكوك موجودا داخل المتبرع بكتريا قولونية. استكمل ثقافة الإشريكية القولونية المانحة بالمضيف Leptospira لتسهيل الاقتران. يؤسس الاقتران اتصالا مباشرا من خلية إلى خلية بين الكائنات الحية ، مما يسهل امتصاص البلازميد المكوكي بواسطة Leptospira. داخل الخلية ، ينتج بناء البلازميد تسلسلات sgRNA ويعبر عن بروتينات dCas9.

يحتوي sgRNA على منطقة فاصل أولي تتعرف على منطقتها المستهدفة التكميلية على الحمض النووي Leptospira ، بالقرب من الشكل المجاور للفاصل الأولي أو PAM - تسلسل التعرف القصير على الحمض النووي المضيف. يساعد هذا dCas9 على تكوين مركب مع sgRNA في الموقع المستهدف في اتجاه مجرى النهر إلى موقع بدء نسخ الجينات.

dCas9 من مركب sgRNA-dCas9 لا يحتوي على النشاط التحفيزي لشق خيوط الحمض النووي ، وبدلا من ذلك ، يعمل كحاجز مادي لحركة إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي