JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:34 د • July 8th, 2025
من أجل التعدين العكسي للحمض النووي الريبي الصغير المتداخل ، أو siRNA ، وهي فئة من الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، إلى الخلايا الشحمية أو الخلايا الدهنية غير الملتصقة ، قم بإعداد تعليق من siRNAs التي تستهدف جينا معينا لترميز البروتين في الخلايا الشحمية. أضف كاشف تعداء دهني كاتيوني مناسب. احتضان الخليط لتشكيل مجمعات تعداء من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية.
انقل الخليط إلى آبار مطلية بالكولاجين في صفيحة متعددة الآبار. تشل مجمعات التعدي على طلاء اللوحة عن طريق تفاعلات غير محددة. ماصة معلق من الخلايا الشحمية في آبار تحتوي على مجمعات تعداء ثابتة. تلتصق الخلايا الشحمية بشكل فضفاض بطلاء اللوحة ، مما يزيد من الاتصال الجسدي بين الخلايا والمجمعات.
يندمج مركب التعدي مع غشاء الخلية ويسلم siRNA إلى السيتوبلازم. يتم التعرف على siRNA ، الذي يتألف من خيط مضاد للمعنى مع تسلسل تكميلي لاستهداف mRNA وخيط إحساس ، بواسطة مركب إسكات الحمض النووي الريبي متعدد البروتينات ، أو RISC. يرتبط siRNA ب RISC ، وتنفصل الخيوط ، مع بقاء الخيط المضاد للمعنى مرتبطا بالمجمع.
يتعرف مركب siRNA-RISC المنشط على المواقع التكميلية على mRNA المستهدف ويرتبط بها. هذا يؤدي إلى انقسام خاص بالتسلسل من mRNA بواسطة بروتين أرجونوت لمركب RISC. يتم تدهور mRNA المشقوق بواسطة الآلية الخلوية ، وبالتالي إسكات التعبير الجيني المستهدف.
ماصة siRNA مع الحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن للخلط ، واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف كاشف الإرسال والحد الأدنى من الوسط الأساسي المحسن إلى siRNA ، والماصة للخلط. احتضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف مزيج التعداء إلى كل بئر من اللوحة المطلية بالكولاجين.
اغسل الخلايا في طبق بتري مقاس 100 ملم مرتين باستخدام DPBS. أضف 5X التربسين إلى الخلايا ، مع التأكد من تغطية السطح بالكامل بالتربسين. انتظر لمدة 30 ثانية ، وقم بإزالة التربسين بعناية. احتضن طبق بتري لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
ثم اضغط على الطبق لفصل الخلايا ، وتجنب تلف الخلايا. أضف 10 ملليلتر من DMEM بدون بيروفات ، و 25 ملي مولار جلوكوز ، و 10٪ FCS ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين ، لتحييد التربسين. قم بتدوير الوسط بعناية لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا وتجانس معلق الخلية.
عد الخلايا باستخدام غرفة عد المالاسيز أو عداد الخلايا الآلي ، واضبط تركيز الخلايا على 6.25 × 105 خلايا / مل من الوسط. بذرة 800 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من صفيحة 12 بئرا ، أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على مزيج التعدين.
احتضان الألواح في حاضنة زراعة الخلايا ، ولا تزعجها لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية بعناية ب DMEM الطازج بدون بيروفات ، و 25 ملي مولار جلوكوز ، و 10٪ FCS ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة.