نظام قابل للتنظيم المحفز: طريقة في المختبر لتعديل التعبير الجيني في الخلايا المستنبتة باستخدام نظام التتراسيكلين
موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 6:19 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بأخذ تعليق الخلايا المتلقية المستنبتة في أنبوب. استكمل الأنبوب بالبلازميدات المحفزة التي تحتوي على الجين المهم. يخضع التعبير عن هذا الجين لسيطرة تسلسل محفز المنبع المدمجة في مشغل التتراسيكلين أو TetO ، مما يشكل عنصرا مستجيبا للتتراسيكلين أو TRE.
بالإضافة إلى ذلك ، أضف نواقل التتراسيكلين التنظيمية ، كل منها يحتوي على جين يشفر بروتين منشط التتراسيكلين المؤتلف أو tTA. قم بالكهرباء بمزيج الخلية والحمض النووي لاستخدام النبضات الكهربائية لتسهيل امتصاص الخلية للبلازميدات.
بعد التثقيب الكهربائي ، قم بلوحة الخلايا واحتضانها للمدة الزمنية المطلوبة. عند دخول النواة ، يعبر ناقل التتراسيكلين عن بروتين tTA. tTA هو بروتين هجين يحتوي على مثبط Tet أو جزء TetR ومجال منشط النسخ الفيروسي VP16.
يربط جزء TetR تسلسل TetO لعنصر TRE ، بينما يسمح مجال VP16 لبوليميراز الحمض النووي الريبي بتصنيع mRNA من الحمض النووي النهائي ، مما يؤدي في النهاية إلى التعبير الجيني. استبدل وسط النمو في صفيحة الاستزراع بوسائط تحتوي على الدوكسيسيكلين واحتضنها.
دوكسيسيكلين - نظير التتراسيكلين الاصطناعي - يرتبط ببروتين TetR ويغير شكله. يعطل هذا التغيير تفاعل بروتين TetR مع تسلسل TetO ، مما يثبط التعبير الجيني المستهدف.
قم بزرع الخلايا في 1 × 106 خلايا / سم2 في أطباق بتري مقاس 100 ملم ، في وجود الحد الأدنى الكامل من الوسط الأس
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية