تحرير الجينات بوساطة مورفولينو: تقنية ضربة قاضية للجينات باستخدام الحظر الانتقالي لقليل النوكليوتيدات مورفولينو في بيض أسماك الكهف أحادية الخلية

المورفولينو عبارة عن قليل النوكليوتيدات قصيرة أحادية الشريطة معاد تصميمها مع اختلافات في العمود الفقري الفوسفات وبنية السكر مقارنة بالنيوكليوتيدات الطبيعية. تعزز هذه الميزات استقرار المورفولينو عند درجة الحموضة الفسيولوجية. على الرغم من هذه الاختلافات ، تحتوي المورفولينو على القواعد النووية القياسية ، والتي تساعد في تصميم قليل النوكليوتيدات المكملة لتسلسل mRNA المحدد من الجين المستهدف المطلوب ليتم هدمه.

لإجراء تحرير الجينات المدفوع بالمورفولينو ، ابدأ بأخذ بيض أسماك الكهف أحادي الخلية الموضوع داخل آبار صفيحة حقن الاغاروز. تخيل البيض الشفاف والمستدير لتحديد موقع كيس الصفار - وهو هيكل مملوء بالسوائل موجود داخل البيضة.

خذ إبرة حقن مجهرية مملوءة مسبقا بمحلول يحتوي على مورفولينوس مصمم. حقن المحلول مباشرة في صفار البيض ، مما يضمن دخول المورفولينو إلى سيتوبلازم الخلية. داخل الخلايا ، يشكل الجين المستهدف mRNA ، والذي يتم نقله إلى السيتوبلازم.

داخل السيتوبلازم ، يهجن المورفولينو المحقون مع نسخة mRNA المستهدفة التكميلية في موقع البدء الداخلي ويمتد إلى ما وراءه. تمنع هذه العملية ارتباط الوحدة الفرعية الأكبر من الريبوسوم بمركب بدء الترجمة الناشئ الذي يتكون من وحدة فرعية ريبوسومية صغيرة معقدة مع بعض البروتينات المحددة.

بعد ذلك ، يتم إعاقة تقدم مجمع بدء الترجمة بشكل استرجعي ، مما يوقف ترجمة mRNA إلى البروتين. أخيرا ، ينخفض تركيز البروتين المستهدف بسبب الحجب الانتقالي بواسطة المورفولينوس.

في يوم الحقن، استخدم ماصة زجاجية لنقل البويضات وحيدة الخلية إلى صفيحة الحقن، واملأ ما يصل إلى خمسة صفوف من صفيحة الحقن ب 30 إلى 40 بيضة لكل صف. حافظ على رطوبة البيض بكمية صغيرة من ماء نظام السمك. قم بإذابة المورفولينو على الثلج ، وقم بإعداد محلول الحقن بحيث يتم حقن 400 بيكوغرام من المورفولينو لكل بيضة ، باستخدام طرف ماصة طويل من Microloader أو إضافة بلعة من 2 إلى 4 ميكرولتر إلى النهاية.

عندما يتم تحميل جميع الإبر ، استخدم الملقط لتقليم الطول الزائد من أطراف إبرة الحقن ، وقم بتركيب الإبرة الأولى في معالج دقيق متصل بحاقن دقيق بيكوليتر. بعد ذلك ، ضع طبق الحقن تحت مجهر تشريح واستخدم الملاعب الدقيقة لاختراق كل بويضة بالإبرة ، قبل حقن 1 نانولتر من محلول حقن المورفولينو مباشرة في صفار البيض.