JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 5:40 د • July 8th, 2025
ابدأ بأجنة أسماك الزرد القابلة للحياة ذات المرحلة الواحدة الموضوعة في آبار قالب الحقن المجهري.
قم بتحميل إبرة الحقن المجهري بمحلول يحتوي على الرنا المرسال المشفر للينقولات Tol2 وبلازميدات مانحة للينقولات. تتكون البلازميدات من محفز لأسماك الزرد في كل مكان وجين مشفر للبروتين الفلوري محاط بأذرع الينقولات Tol2.
قمبحقن محلول الحقن المجهري بعناية في سيتوبلازم جنين الزرد. داخل الخلية ، تترجم Tol2transposase mRNAs إلى بروتينات الترانسبوزاز Tol2 ويتم نقلها بنشاط إلى النواة.
تشتمل مواقع Tol2 على بلازميد المتبرع على تكرارات طرفية مقلوبة محددة ، أو ITRs ، تحيط بجين المراسل. ويحيط بلوائح الاتصالات الدولية تكرارات قصيرة ومباشرة. تتعرف بروتينات الترانسبوزاز على مواقع ITR وترتبط بها ، وتشكل دبوسا حادا على الحمض النووي المحيط بها. تعمل الترانسبوزاز على شق بنية الينقولات من الحمض النووي المحيط بها ، وتطلقه من البلازميد وتترك وراءها تكرارات قصيرة ومباشرة.
تخلق الينقولات انفصالا مزدوجا متداخلا في جينوم الخلية الجسدية وتدخل بنية الينقولات في موقع الجينوم. يؤدي ملء الفجوة في الأطراف المتداخلة بواسطة بوليميراز الحمض النووي متبوعا بربط النكات إلى تكرارات قصيرة ومباشرة.
يتسبب الربط في تكامل بناء الينقولات المستقرة في جينوم الخلية الجسدية ، ويسهل المحفز التعبير عن البروتين الفلوري. احتضان الأجنة المحقونة. أثناء التطور الجنيني ، تؤدي الخلايا الجسدية إلى ظهور أنواع مختلفة من الخلايا وإنشاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا.
بعد تحضير Tol2 transposase mRNA ومحلول الحقن ، وفقا لبروتوكول النص ، بعد ظهر اليوم قبل الحقن ، قم بإعداد أربعة إلى ستة خزانات تكاثر مع اثنين على الأقل من الذكور وأنثى. لتقليل كمية نفايات الأسماك ، وللحث على استجابة التكاثر ، تجنب إطعام الأسماك في فترة ما بعد الظهر.
في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الحقن المحضر من الفريزر سالب 80 درجة مئوية ، وضعه على الثلج. اسحب الفواصل في أحواض تربية الأسماك واترك الأسماك تتزاوج. بشكل عام ، تضع الأسماك البيض في غضون 20 إلى 30 دقيقة.
أثناء الانتظار ، باستخدام مجتذب ماصة دقيقة مع المعلمات التالية ، اسحب الإبر من الزجاج الشعري. استخدم منديل مختبري لكسر نهاية الإبرة وإنشاء حافة مشطوفة. يفضل قطر أصغر لتقليل وفيات الأجنة.
بمجرد أن تضع الأسماك البيض ، اجمعها في طبق بتري قطره 10 سم. مباشرة تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جميع الأجنة غير الطبيعية ونفايات الأسماك. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأجنة المخصبة في قالب حقن الاغاروز المحضر بنسبة 3٪. قم بإزالة الماء الزائد للمساعدة في الحفاظ على الأجنة في مكانها.
بمجرد ملء جميع الصفوف بأجنة قابلة للحياة ، قم بترتيبها بحيث يتم توجيه جميع الخلايا المفردة بزاوية 45 درجة أفقيا فيما يتعلق بالإبرة. هذا سيجعل الحقن أسهل بكثير في وقت لاحق. بعد ذلك ، أثناء ارتداء القفازات ، استخدم طرف ماصة تحميل سعة 20 ميكرولترا لإزالة 5 ميكرولتر من الهيكل المحضر من الأنبوب الموجود على الجليد.
أدخل طرف الماصة بحذر في الطرف الخلفي للأنبوب الشعري المكسور إلى حيث يبدأ في الاستدقاق، لجعل الكاشف أقرب ما يمكن إلى الطرف، وطرده في الشعيرات الدموية. إذا كانت لا تزال هناك فقاعات هواء ، فقم بهز الإبرة ، وتأكد من عدم كسر الحافة.
أدخل الإبرة مباشرة في حامل إبرة الحقن المجهري ، وشد بعناية حتى تبقى الإبرة في مكانها ، ثم اضبط الزاوية على حوالي 45 درجة. بمجرد تحضير الإبرة وتثبيتها ، قم بتشغيل المجهر وخزان ضغط الغاز. اضبط حجم الحقن باستخدام ما يقرب من 0.5 رطل لكل بوصة مربعة للتثبيت و 30 رطل لكل بوصة مربعة للطرد.
تأكد من خروج المحلول من الإبرة عند الضغط على الدواسة. باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني ، اضبط حجم وتدفق المحلول إلى قطر 10 ميكرومتر تقريبا. تأكد من أن الضغط الخلفي يسمح بكمية صغيرة من المحلول بالتنقيط من الإبرة.
إذا لم يكن هناك ضغط خلفي كاف ، فإن العمل الشعري سيؤدي إلى دخول السائل إلى الإبرة وتدمير mRNA. بمجرد معايرة الإبرة ، أدخل الإبرة في الخلية المفردة للأجنة المخصبة باستخدام حافة الشق الهلامي لتوفير دعامة تحافظ على الجنين في مكانه ، وتسمح للإبرة بالضغط دون تحريك الجنين.
بمجرد أن يصبح طرف الإبرة في الخلية المفردة ، اضغط على الدواسة لتحرير الكمية المطلوبة من المحلول. من المهم حقن المحلول في الخلية ، وليس صفار البيض لتوليد سمك الزرد المعدل وراثيا. كرر هذه العملية لجميع الأجنة.
عند الانتهاء ، استخدم ماصة نقل سعة 3.4 مل يمكن التخلص منها ومياه نظام الأسماك لنقل الأجنة المحقونة إلى طبق مصنف عن طريق شطفها من شق الاغاروز. قم بتخزين الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية للسماح لها بالنمو.