موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:29 دقيقة • July 8th, 2025
ابدأ بتعليق الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، hiPSCs ، في مخزن مؤقت مناسب للتثقيب الكهربائي. أضف محلولا يتكون من بلازميدات ترميز PiggyBac والبلازميدات المانحة. التثقيب الكهربائي الخليط.
تتخلل النبضات الكهربائية أغشية الخلايا بشكل عابر ، مما يسهل امتصاص الخلايا للبلازميدات. تشتمل البلازميدات المانحة على تكرارات طرفية مقلوبة خاصة بالينقولات ، ITRs ، وهي مكملات مقلوبة لبعضها البعض ، محاطة بتكرارات TTAA بين قوسين البروتين المستهدف وجينات مقاومة المضادات الحيوية.
تخلق بروتينات الترانسبوزاز PiggyBac المعبر عنها شقوقا في نهايات 3 من ITRs ، داخلية لتكرار TTAA. تهاجم مجموعات الهيدروكسيل المكشوفة 3'-الهيدروكسيل نيوكليوتيدات الخيط التكميلي داخل الحمض النووي المرافق ، وتشكل دبابيس شعر TTAA على نهايات الينقولات ، وبالتالي إطلاق بنية الينقولات من البلازميد.
تعمل الينقولات على حل دبابيس الشعر لتشكيل نتوءات TTAA في نهايات 5 'من بنية الينقولات. تخلق الينقولات أيضا فواصل مزدوجة الخيط في تسلسل TTAA في جينوم المضيف. تهاجم نهايات الينقولات 3'-hydroxyl التي تم إطلاقها تسلسل TTAA في النهايات المتداخلة ، مما يؤدي إلى الارتباط التساهمي لبناء الينقولات بالجينوم المضيف ، مما يترك فجوات أحادية الخيط تحيط ببناء الينقولات. يتم ربط هذه الفجوات في الحمض النووي المضيف ، مما يؤدي إلى تكامل مستقر لبناء الينقولات.
عالج hiPSCs المصنفة على صفيحة مغلفة بالبروتين خارج الخلية بوسائط تحتوي على المضادات الحيوية. يتيح جين مقاومة المضادات الحيوية ، الذي يقوده المحفز الأولي ، اختيار الخلايا المعدلة جينيا.
اشطف مزرعة iPSC البشرية باستخدام PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم ، قبل معالجة الخلايا بكاشف تفكك الخلايا لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال عن حاوية الاستزراع، استخدم ماصة P1000 لفصل الخلايا يدويا برفق من 3 إلى 4 مرات.
انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وارفع الحجم النهائي إلى 10 مل مع PBS الطازج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، للعد. اجمع 1 × 106 خلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت R من مجموعة التثقيب الكهربائي.
أضف 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد القابل للنقل ، و 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد PiggyBac transposase للتعداد. قم بعمل جهاز نقل كهربائي للخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مع المعلمات المشار إليها. ثم. بذر الخلايا في وسط iPSC البشري المكمل ب 10 مثبطات ROCK ميكرومولار Y-27632 في طبق مغطى بمصفوفة 6 ملم.