JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:13 د • July 8th, 2025
للتخلص من جينات متعددة في وقت واحد باستخدام نظام CRISPR-concatemer-Cas9 ، ابدأ بأنبوب يحتوي على تعليق الخلايا المعوية للفأر. استكمل الأنبوب بنواقل CRISPR-concatemer التي تحتوي على كاسيت التعبير ل RNAs التوجيهية المتعددة ، أو gRNAs ، المدمجة بجوار بعضها البعض.
تم تصميم كل شريط gRNA خصيصا لضرب الجين المقصود بشكل فردي. أضف متجهات التعبير التي تشفر نوكلياز Cas9 إلى نفس الأنبوب. قم بالكهرباء بخليط الخلية البلازميد - وهي تقنية تستخدم التيار الكهربائي لتسهيل دخول البلازميدات إلى الخلية. داخل الخلية ، يشكل التعبير المشترك ل CRISPR-concatemer و Cas9 متجه تسلسلات gRNA و Cas9 نوكليازات ، على التوالي.
يرتبط كل تسلسل gRNA بإنزيم Cas9 المقابل ، مكونا العديد من مجمعات Cas9-gRNA التي ترتبط بالمواقع المستهدفة في جينوم المضيف. ينشط هذا الارتباط إنزيم Cas9 ، الذي ينتج شقا في كل من خيوط الحمض النووي في المنبع إلى موقع الفاصل الأولي المجاور ، أو PAM. ينتج عن هذا كسر مزدوج الخيط ، أو DSB ، في الحمض النووي المستهدف.
في حالة عدم وجود أي تسلسل متماثل للجين المستهدف ، يتم تشغيل آلية الإصلاح الذاتية للخلية ، والتي تسمى الانضمام النهائي غير المتماثل ، مما يسمح لبروتينات الإصلاح وجزيئات كيناز بالارتباط في موقع الكسر. في وقت لاحق ، يقوم إنزيم ligase بإصلاح DSB ، مما يؤدي إلى تعديلات في تسلسل الجينات المستهدفة. هذه التعديلات تعطل وظيفة الجينات ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية متعددة للجينات.
ابدأ هذا الإجراء بإضافة 9 ملليلتر من وسط المصل المخفض إلى أنبوب 15 مليلتر الذي يحتوي على تعليق الخلية ، وجهاز الطرد المركزي عند 400 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة كل المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في محلول التثقيب الكهربائي. أضف كمية إجمالية قدرها 10 ميكروغرامات من الحمض النووي إلى أنبوبين جديدين. بعد ذلك ، أضف محلول التثقيب الكهربائي إلى الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر واحتفظ بخليط الخلية والحمض النووي على الجليد.
انقل خليط الخلية والحمض النووي إلى كوفيت التثقيب الكهربائي. ضع الكوفيت في حجرة المثق الكهربائي. قم بقياس المعاوقة بالضغط على الزر المناسب على المثقور الكهربائي ، وتأكد من أنه من 0.030 إلى 0.055 أوم. قم بإجراء التثقيب الكهربائي وفقا للإعدادات الموضحة في بروتوكول النص. أضف 400 ميكرولتر من مخزن التثقيب الكهربائي بالإضافة إلى مثبط ROCK إلى الكوفيت ، ثم انقل جميع محتوياته إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي. بعد 30 دقيقة ، قم بالدوران على حرارة 400 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر لكل بئر من مصفوفة الطابق السفلي. قم بزرع ما يقرب من 1 × 104 إلى 1 × 105 خلايا لكل بئر في صفيحة 48 بئرا ، وأضف EGF بالإضافة إلى مثبط Noggin GSK-3 ، ومثبط ROCK ، و 1.25٪ وسط ثنائي ميثيل سلفوكسيد. احتضان عند 37 درجة مئوية.