ضربة قاضية متعددة الجينات بوساطة كريسبر: تقنية لضربة قاضية متعددة في وقت واحد عن طريق مسار الانضمام النهائي غير المتماثل في خلايا الأمعاء الفئرانية

للتخلص من جينات متعددة في وقت واحد باستخدام نظام CRISPR-concatemer-Cas9 ، ابدأ بأنبوب يحتوي على تعليق الخلايا المعوية للفأر. استكمل الأنبوب بنواقل CRISPR-concatemer التي تحتوي على كاسيت التعبير ل RNAs التوجيهية المتعددة ، أو gRNAs ، المدمجة بجوار بعضها البعض.

تم تصميم كل شريط gRNA خصيصا لضرب الجين المقصود بشكل فردي. أضف متجهات التعبير التي تشفر نوكلياز Cas9 إلى نفس الأنبوب. قم بالكهرباء بخليط الخلية البلازميد - وهي تقنية تستخدم التيار الكهربائي لتسهيل دخول البلازميدات إلى الخلية. داخل الخلية ، يشكل التعبير المشترك ل CRISPR-concatemer و Cas9 متجه تسلسلات gRNA و Cas9 نوكليازات ، على التوالي.

يرتبط كل تسلسل gRNA بإنزيم Cas9 المقابل ، مكونا العديد من مجمعات Cas9-gRNA التي ترتبط بالمواقع المستهدفة في جينوم المضيف. ينشط هذا الارتباط إنزيم Cas9 ، الذي ينتج شقا في كل من خيوط الحمض النووي في المنبع إلى موقع الفاصل الأولي المجاور ، أو PAM. ينتج عن هذا كسر مزدوج الخيط ، أو DSB ، في الحمض النووي المستهدف.

في حالة عدم وجود أي تسلسل متماثل للجين المستهدف ، يتم تشغيل آلية الإصلاح الذاتية للخلية ، والتي تسمى الانضمام النهائي غير المتماثل ، مما يسمح لبروتينات الإصلاح وجزيئات كيناز بالارتباط في موقع الكسر. في وقت لاحق ، يقوم إنزيم ligase بإصلاح DSB ، مما يؤدي إلى تعديلات في تسلسل الجينات المستهدفة.