مقايسة تسرب التألق لدراسة تفاعل الببتيد المخترق للخلايا مع الغشاء

يمكن للببتيدات المخترقة للخلايا ، CPPs ، والببتيدات القصيرة الموجبة الشحنة ، أن تتفاعل مع الأغشية الخلوية وتعبرها ، مما يسهل توصيل الشحنات غير المنفذة للخلايا.

لدراسة إمكانات نفاذية الغشاء لاختبار CPP في المختبر باستخدام تقليد غشاء الخلية ، ابدأ بحويصلة أحادية الصفيحة كبيرة ، LUV ، معلق.

تتكون LUVs من طبقة ثنائية الفوسفوليبيد محملة بمسبار فلوري غير منفذ للغشاء وزوج مروي مقابل. داخل الحويصلات ، يتفاعل المروي مع مسبار الفلورسنت بسبب قربها الشديد ، مما يتسبب في تبريد الفلورة.

ماصة تعليق LUV في كوفيت مضان كوارتز ، وتخفيفه باستخدام المخزن المؤقت. أضف شريطا مغناطيسيا. انقله إلى مقياس الطيف فلوري مع التحريك المغناطيسي لمنع ترسيب LUV أثناء التشغيل. حدد مضان الخلفية للتخلص من أي تسرب للأشعة الكهربية المنخفضة.

أضف التركيز المطلوب من CPP إلى تعليق LUV على فترات منتظمة.

بناء على الكراهية للماء وشحنة بقايا الأحماض الأمينية في CPPs ، فإنها تزعج الغشاء الدهني LUV ، مما يؤدي إلى تغلغل الغشاء ونفاذه.

يتسبب تلف غشاء الحويصلة في تسرب مسبار الفلورسنت والتبريد في المحلول المحيط ، مما يزيد من فصلهما المكاني. نتيجة لذلك ، يظهر المسبار تألق.

تؤدي إضافة محلول CPP الإضافي إلى زيادة نفاذية LUV وشدة الفلورة. تشير الزيادة في شدة التألق مع إضافة CPP إلى إمكانية نفاذية غشاء الببتيد.

لقياس تسرب التألق ، قم بتخفيف LUVs في 1 مليلتر من HEPES Buffer 2 في كوفيت مضان كوارتز إلى تركيز نهائي 100 ميكرومولار ، وأضف محرك مغناطيسي لتسهيل تجانس المحلول أثناء التجربة.

قم بقياس LUVs وحدها خلال أول 100 ثانية لتقييم مضان الخلفية ، قبل قياس التسرب كزيادة في شدة التألق عند إضافة حصص من محلول الببتيد خلال 900 ثانية التالية.

لقياس تسرب التألق بنسبة 100٪ كعنصر تحكم إيجابي ، أضف 1 ميكرولتر من Triton X-100 إلى LUVs لإذابة الحويصلات ، مما يؤدي إلى فك كامل للمسبار خلال آخر 100 ثانية من التحليل. بعد ذلك ، استخدم الصيغة لحساب نسبة التسرب في كل نقطة زمنية.