تفاعل بوليميراز القطرات الرقمية للكشف عن طفرات Indel في الجينات المستهدفة

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 4:34 د • July 8th, 2025

يكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية طفرات إندل — إدخال أو حذف عشوائي للنيوكليوتيدات في الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقسيم العينة إلى قطرات صغيرة وتضخيم الحمض النووي بشكل مستقل في كل قطرة.

لإجراء ddPCR ، خذ عينة من الحمض النووي تحتوي على أشكال مختلفة من النوع البري والمتحورة للجين المستهدف. قم بتحميل مزيج العينة والزيت في مقصورات مميزة لغرفة مولد القطرات التي تحتوي على قناة الموائع الدقيقة.

تتدفق العينة والزيت بسرعة عبر القنوات الضيقة ، وتستحلب عند التقاطع ، ويتم تقسيمها إلى عدة قطرات ، تحتوي كل منها على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي.

الآن ، خذ لوحة PCR مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على بادئات أمامية وخلفية ، و dNTPs ، وبوليميراز DNA القابل للحرارة ، ومسبارين موسومين بفلوروفورات مختلفة وجزيئات مروية. كل مسبار خاص بنوع معين من الأليل - من النوع البري أو المتحور.

انقل القطرات إلى لوحة PCR. ضع اللوحة في جهاز تدوير حراري ، وقم بتشغيل التفاعل. أثناء التمسخ ، تنفصل خيوط الحمض النووي. في درجة حرارة التلدين ، تلدين البادئات والمجسات إلى الحمض النووي للقالب.

يرتبط المسبار مع الفلوروفورات الخضراء والبرتقالية بتسلسل الحمض النووي من النوع البري والمتحور على التوالي. في وقت لاحق ، يمتد بوليميراز الحمض النووي إلى البادئات ، ويشق جزيئات الفلوروفور والتبريد من المسبار ، مما يولد إشارة مضانة.

تحليل المنتج المضخم. تحتوي القطرات التي تظهر التألق الأخضر على تسلسل الحمض النووي من النوع البري ، بينما يشير التألق البرتقالي إلى طفرة indel.

بادئ ذي بدء ، قم بإعداد 25 ميكرولترا من مزيج عينة القطرات الرقمية PCR أو ddPCR عن طريق إضافة مزيج ddPCR الفائق ، والبادئات الأمامية والخلفية ، ومجسات HEX أو FAM ، والحمض النووي ، والماء بالنسب الموضحة في النص. ثم امزج التفاعل جيدا عن طريق الدوامة.

باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 50 ميكرولترا، قم بتحميل 20 ميكرولترا من مزيج عينة ddPCR في الصف الأوسط من الخرطوشة. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر لتحميل 70 ميكرولترا من الزيت في الصف السفلي دون توليد فقاعات طوال عملية سحب العينات.

ضع الحشية ، مع لمس الحواف فقط ، وتجنب المنطقة المقعرة المركزية ، ثم ضع اللوحة بإحكام في مولد القطرات ، وأغلق الغطاء لبدء التشغيل.

لنقل مزيج الغمر من الصف العلوي من الخرطوشة إلى اللوحة التي تحتوي على 96 بئرا، استخدم ماصة متعددة القنوات واسحب 40 ميكرولترا من العينة السائلة لمدة 3 إلى 5 ثوان بزاوية 30 إلى 45 درجة. بعد ذلك ، طرد الخليط في البئر ببطء لأكثر من 3 ثوان بزاوية 45 درجة ، مما يسمح له بالسقوط من الجانب ، ثم انتقل إلى المحطة الثانية للماصة لطرد السائل تماما. باستخدام أختام حرارية من رقائق الألومنيوم ، أغلق الألواح لمدة 5 ثوان عند 180 درجة مئوية.

ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري واضبط شروط PCR لإرشادات NHEJ Drop-Off عن طريق ضبط التمسخ الأولي على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اضبط 40 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لتغيير الطبيعة ، و 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة للتلدين ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين للتمديد.

بعد 40 دورة ، اضبط الثبات على 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، واضغط أخيرا على 4 درجات مئوية. استخدم معدل منحدر يبلغ 2 درجة مئوية في الثانية لجميع الخطوات. ستختلف درجة حرارة التلدين وفقا للمجسات أو التمهيدي المستخدم. ضع اللوحة بإحكام في قارئ القطرات مع وضع علامة A1 جيدا في أعلى اليسار.

افتح البرنامج وقم بإعداد اللوحة عن طريق تعيين FAM كقناة مرجعية معروفة و HEX كقناة غير معروفة لكل بئر. ثم قم بتغيير اسم كل عينة. قم بتشغيل تجربة قراءة القطرات كقياس كمي مباشر أثناء حفظ القالب.

13:00

دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

11:27

كفاءة الإنتاج وتحديد كريسبر/Cas9-المنشأة الضربة القاضية الجينات في "النظام النموذجي" دانيو rerio

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

09:04

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:07

تفاعل البوليميراز الرقمي المتسلسل: طريقة لتوليد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات النانوية للكشف عن طفرات الورم النادرة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:28

تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد القطرات للكشف عن مثيلة الحمض النووي في الكريات البيض

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:32

تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الأنبوب للقياس الكمي لمتغيرات النوكليوتيدات المفردة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:50

تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الرقاقة للكشف عن متغيرات النسخ النادرة باستخدام شريحة نانو فلويد

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:16

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:23

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:58

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 29 أغسطس 2026