تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج لتحديد درجة حرارة التلدين المثلى

تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج هو تقنية لتحسين درجة حرارة التلدين التي ترتبط عندها بادئات - الحمض النووي أحادي الشريطة الخاص بالتسلسل - بالمواقع التكميلية على الحمض النووي للقالب.

خذ مزيجا يحتوي على بادئات أمامية وخلفية ، و dNTPs ، وبوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة في مخزن مؤقت مناسب. أضف الحمض النووي للقالب وانقل المكونات إلى لوحة PCR.

ضع اللوحة في جهاز تدوير حراري متدرج مع كتلة تسخين متخصصة. هذا يحدد تدرجا خطيا لدرجة حرارة التلدين بين 55 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية ، مع زيادة ثابتة في درجة الحرارة في جميع أنحاء اللوحة.

يقوم التفاعل بتسخين اللوحة عند درجة حرارة عالية ، مما يؤدي إلى تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة وتنشيط بوليميراز الحمض النووي. في وقت لاحق ، يتم خفض درجة الحرارة وفقا للقيم المبرمجة في كل بئر ، مما يسهل التلدين التمهيدي.

عند درجة حرارة التلدين المثلى ، ترتبط البادئات بشكل غير محدد بالحمض النووي المشوه ، مما يؤدي إلى تضخيم غير محدد أثناء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). عند درجة الحرارة المثلى ، ترتبط كميات غير كافية من الاشعال بالحمض النووي.

عند درجة الحرارة المثلى ، ترتبط الاشعال على وجه التحديد بالحمض النووي المستهدف. بعد ذلك ، تزداد درجة الحرارة قليلا ، مما يسمح للبوليميراز بتمديد البادئات باستخدام dNTPs. تؤدي دورات التمسخ والتلدين والتمديد المتكررة هذه إلى تضخيم الحمض النووي.

تحليل المنتج في كل بئر. تظهر الآبار ذات درجات حرارة التلدين غير المثلى تضخيما أقل أو غير محدد.

تنتج

درجة حرارة التلدين المثلى أقصى تضخيم محدد للحمض النووي.

لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج ، ابدأ بإعداد مزيج رئيسي. بعد ذلك ، قم بإزالة 19 ميكرولترا من المزيج الرئيسي للتحكم غير القالب ، أو NTC ، في لوحة 96 بئر. ثم أضف القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقي. Aliquot 20 ميكرولترا من مزيج العينة في اللوحة المكونة من 96 بئرا. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع معلمات ركوب الدراجات ، ثم قم بإنشاء ملفات تعريف الذوبان الحراري ، باستخدام المعلمات المذكورة في المخطوطة.