تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج للقياس الكمي المتزامن للعلامات الجينية المزدوجة

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج - ddPCR - بالكشف الكمي المتزامن عن علامتين جينيتين متميزتين.

للبدء ، خذ عينة تحتوي على تسلسلين مختلفين للهدف. أضف خليطا يحتوي على إنزيم بوليميراز DNA المقاوم للحرارة ، و dNTPs ، والبادئات الخاصة بالهدف. بعد ذلك ، أضف مجسين مختلفين من قليل النوكليوتيدات الخاص بالهدف ، المسمى بمراسلي الفلورسنت وجزيء التبريد لاكتشاف الأهداف المضخمة.

استحلاب المحلول بالزيت لتقسيم التسلسلات المستهدفة إلى العديد من القطرات النانوية. تعمل كل قطرة تحتوي على الهدف كوعاء تفاعل فردي.

ابدأ عملية التدوير الحراري لتفاعل التضخيم داخل القطرات النانوية الفردية.

عند درجة حرارة التمسخ العالية ، تنفصل الأهداف ذات الشريطة المزدوجة إلى خيوط مفردة.

اخفض درجة الحرارة للوصول إلى درجة حرارة التلدين المناسبة ، مما يسمح للبادئات ومجسات قليل النوكليوتيدات بالارتباط بالقالب.

قرب المروي يمنع تألق المراسل. عند درجة حرارة التمدد ، يمتد بوليميراز الحمض النووي البادئات ويشقق مسبار قليل النوكليوتيدات. المراسل غير المرتبط ينبعث منه تألق.

مرر القطرات عبر قارئ القطرات - نظام الكشف عن الفلورة. يشير اكتشاف التألق الفردي أو المزدوج إلى قطرات موجبة تحتوي على أهداف ، بينما يشير عدم وجود إشارة إلى قطرات سلبية.

نسبة القطرات الموجبة إلى العدد الإجمالي للأقسام التركيز الأولي للتسلسلات المستهدفة.

لبدء هذا الإجراء ، أولا ، قم بإعداد تركيزات مخزون 100 ميكرومول لكل لتر لجميع البادئات في المياه الجزيئية والمجسات في المخزن المؤقت TE pH 8 ، كما هو موضح في نص البروتوكول. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي عن طريق خلط كميات مناسبة من مزيج PCR الرقمي ، والبادئات الأمامية والعكسية ، ومسبار الفلورسنت ، والماء الخالي من النوكلياز. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل للخلط ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في المحلول.

نظرا لأن المزيج الرئيسي dPCR أكثر لزوجة من مزيج qPCR الرئيسي التقليدي ، فمن الضروري استخدام الخلط عن طريق تقنية سحب العينات من أجل إنشاء حل متجانس. هذا يسمح بقياس dPCR بدقة في اتجاه المصب.

لعمل خليط الفحص لتوليد القطرات لتشغيل العينات في نسختين، قم بتعبئة 36 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العادية. لكل مزيج من الخلطات الرئيسية سعة 36 ميكرولتر ، امزج 12 ميكرولترا من قالب الحمض النووي ، مع ترك الآبار المتكررة المقابلة فارغة على اللوحة. قم بتضمين عناصر تحكم إيجابية لضمان تشغيل الاختبار بشكل صحيح. قم بتضمين No Template Controls أو NTCs لضمان عدم وجود تلوث داخل اللوحة ، ولتعيين خط الأساس الفلوري لاحقا لتحليل البيانات.

قبل إعداد مولد القطرات، امزج مخاليط الفحص باستخدام ماصة متعددة القنوات لتحريك المخاليط لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا. تأكد من بقاء طرف الماصة داخل السائل لتجنب تكوين فقاعات زائدة داخل الخليط.

بعد ذلك ، أدخل الخرطوشة الأولى ، التي تحتوي على ثمانية آبار ، في حامل خرطوشة أبيض وانقر فوق حامل الخرطوشة للإغلاق. الخرطوشة الأولى الآن ثابتة في مكانها ، ولا يمكن إزاحتها من الحامل أثناء توليد قطرات.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 20 ميكرولترا من خليط الفحص برفق إلى الموضع الأوسط للخرطوشة التي تحمل علامة "عينة" دون إدخال فقاعات هواء. الماصة في 70 ميكرولترا من زيت توليد القطرات على الجانب الأيسر من الخرطوشة التي تحمل علامة "زيت".

قم بتغطية الخرطوشة بحشية ، وتأكد من أن الحشية مسطحة ومثبتة بالتساوي بواسطة العلامات الأربعة باتجاه حافة الخرطوشة. اضغط على الزر المضاء باللون الأخضر في مولد القطرات لفتح الباب ووضع الخرطوشة. اضغط على الزر مرة أخرى لإغلاق المولد. بمجرد إغلاق الباب ، يتم تعتيم الزر الأخضر ولا يمكن إعادة فتح الباب.

سيبدأ توليد القطرات على الفور ويستمر لمدة دقيقة واحدة تقريبا.

أثناء تقدم توليد القطرات ، ضع الخرطوشة الثانية في حامل خرطوشة بيضاء ثان ، وقم بإعدادها بنفس طريقة الخرطوشة الأولى. عند اكتمال توليد القطرات ، سيتحول الزر ذي الإضاءة الخافتة إلى اللون الأخضر.

افتح باب مولد القطرات. قم بإزالة حامل الخرطوشة الأبيض الذي يحتوي على خرطوشة واحدة وضعه جانبا. ضع الخرطوشة الثانية في مولد القطرات.

قم بإزالة الحشية من الخرطوشة وتخلص منها. لا تقم بإلغاء النقر فوق حامل الخرطوشة الأبيض ، حيث قد يؤدي الإجراء إلى كسر القطرات التي تم إنشاؤها حديثا.

باستخدام ماصة متعددة القنوات مضبوطة على 40 ميكرولترا، أدخل الأطراف في العمود الثالث من القطرات المميزة بالخرطوشة بزاوية 45 درجة، وقم بسحب جميع القطرات ببطء. انقلها إلى لوحة PCR النهائية عن طريق وضع طرف الماصة على جدار البئر في منتصف الطريق تقريبا وطرد القطرة ببطء.

بنفس الطريقة ، عند اكتمال توليد القطرات للخرطوشة الثانية ، قم بإزالة الحشية من الخرطوشة الثانية ، وانقل القطرات المتولدة إلى لوحة PCR النهائية. ضع غطاء رقائق معدنية قابل للثقب أعلى الطبق وضعه على مادة مانعة للتسرب من اللوحة. اضبط مانع التسرب على 180 درجة مئوية. اضغط على "تشغيل" على السدادة وأغلقها لمدة 10 ثوان.

لبدء هذا الإجراء ، ضع لوحة PCR النهائية المختومة في التدوير الحراري. استخدم جهاز تدوير حراري متوافق مع لوحة PCR النهائية ، وبسرعة زيادة درجة الحرارة تبلغ 2 درجة مئوية في الثانية.

قم بتشغيل البرنامج الحراري التالي: 10 دقائق عند 95 درجة مئوية تليها 40 دورة من 30 ثانية عند 94 درجة مئوية و 60 ثانية عند 60 درجة مئوية تليها 10 دقائق عند 98 درجة مئوية. عند الانتهاء من ركوب الدراجات ، انقل اللوحة إلى قارئ قطرات للقياس التلقائي للتألق في كل قطرة في كل بئر.

تأكد من أن القطرات في درجة حرارة الغرفة قبل متابعة قراءة القطرات. ابدأ بفتح البرنامج المصاحب لإعداد قراءة القطرات. في قائمة "الإعداد" الافتراضية التي تحتوي على مخطط للوحة فارغة مكونة من 96 بئرا ، انقر نقرا مزدوجا فوق البئر A1 لفتح القائمة التي تحتوي على ثلاثة أقسام - "عينة" و "مقايسة 1" و "مقايسة 2".

في قسم العينة ، اكتب معرف العينة في المربع المسمى "الاسم" وحدد المربع الموجود على اليمين الذي يحمل علامة "تطبيق". بعد ذلك ، انقر فوق القائمة المنسدلة المسماة "تجربة". اختر "RED" لاكتشاف الأحداث النادرة وانقر فوق "إدخال".

انتقل إلى القسم المشار إليه باسم "A1". في قسم "الاسم" ، املأ الفحص وانقر فوق "إدخال". في المربع أدناه المسمى "النوع" ، انقر فوق القائمة المنسدلة ، واختر "القناة 1 غير معروفة" ، وانقر فوق "إدخال".

انتقل إلى القسم المشار إليه باسم "A2". في قسم "الاسم" ، املأ الفحص وانقر فوق "إدخال". في المربع أدناه المسمى "النوع" ، انقر فوق القائمة المنسدلة ، واختر "القناة 2 غير معروفة" ، وانقر فوق "إدخال".

جميع المعلومات من الخطوات السابقة موجودة الآن في البئر A1.

قم بتسمية جميع الآبار اللاحقة التي تحتوي على قطرات. لتوفير إجمالي وقت الإعداد ، انقر فوق "Shift" أو "Control" لاختيار آبار متعددة في وقت واحد. عندما يعكس التصوير الرقمي للوحة اللوحة المادية ، اضغط على "موافق" في أسفل يمين القائمة. في القائمة الجديدة التي تظهر في الجزء العلوي من مخطط اللوحة ، ضمن قسم "القالب" ، اختر "حفظ باسم" وقم بتسمية اللوحة وحفظها.

على يسار الشاشة ، انقر فوق "تشغيل" وحدد مجموعة الصبغات المناسبة في نافذة "خيارات التشغيل" المنبثقة. سيبدأ جمع البيانات ويتم عرضه في الوقت الفعلي في البرنامج.