PCR للنسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي لتشخيص الالتهابات الفيروسية

PCR للنسخ العكسي الكمي في الوقت الفعلي مفيدا لتحديد الالتهابات الفيروسية.

ابدأ بعينة تحتوي على الحمض النووي الريبي الفيروسي المستهدف. أضف بادئات خاصة بالهدف - تساعد في كل من تخليق الحمض النووي وتضخيمه - جنبا إلى جنب مع إنزيم النسخ العكسي و dNTPs.

أضف بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة - وهو إنزيم لتضخيم الحمض النووي عبر دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل - و SYBR green - وهي صبغة تداخل في الحمض النووي مزدوج الشريطة ، dsDNA. ضع التفاعل في دورة حرارية. اضبط درجة حرارة مناسبة لربط البادئات بالحمض النووي الريبي المستهدف.

يضيف النسخ العكسي dNTPs إلى التمهيدي بينما يشق الحمض النووي الريبي للقالب في نفس الوقت ، ويصنع (cDNA).

قم بزيادة درجة الحرارة ، وتعطيل النسخ العكسي. اخفض درجة الحرارة ، مما يسمح للبادئات بالتلدين ب (كدنا) لتضخيمها لاحقا. قم بزيادة درجة الحرارة للوصول إلى خطوة التمديد ، حيث يمتد بوليميراز الحمض النووي إلى البادئات ، وتجميع dsDNA.

الدورات المتتالية إلى تضخيم dsDNA الأسي. يرتبط SYBR الأخضر بالحمض النووي بأعداد متزايدة ، مما يتسبب في زيادة نسبية في انبعاث التألق. ارسم إشارة التألق المكتشفة عبر الدورات.

يشير منحنى التضخيم الإيجابي إلى وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي في العينة.

قم بزيادة درجة الحرارة بشكل تدريجي للوصول إلى درجة حرارة الانصهار ، وتحويل DSDNA إلى خيوط مفردة. يتم إطلاق جزيئات الصبغة المرتبطة - تفقد تألقها. ارسم التألق المتناقص مقابل درجة الحرارة.

تؤكد الذروة المقابلة لدرجة حرارة الانصهار الخاصة بالفيروس العدوى الفيروسية.

خطط لتخطيط لوحة PCR الخاصة بك باستخدام جدول بيانات، مع مراعاة عينات الاختبار والتحكم على حد سواء. قم بإعداد محطة عمل PCR عن طريق تطهير الأسطح ، وإذا كنت تستخدم خزانة للأشعة فوق البنفسجية ، فقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل 10 دقائق من البدء.

قم بإزالة الكواشف والبادئات من الفريزر لإذابة الجليد ، لكن احتفظ بمزيج الإنزيم على الثلج في جميع الأوقات. امزج الكواشف وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل. إعداد خلطات PCR الرئيسية لفيروس الليسا وبيتا أكتين ، وفقا لتوجيهات المخطوطة. اترك الخلطات الرئيسية على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام. قم بخلط الخلطات الرئيسية المحضرة وقم بالطرد المركزي ، وقم بتوزيع 19 ميكرولترا في الآبار ذات الصلة للوحة أو شريط الأنبوب المتوافق مع جهاز PCR.

في غرفة منفصلة أو خزانة للأشعة فوق البنفسجية ، أضف بعناية 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المحضر. إذا كنت تستخدم خزانة للأشعة فوق البنفسجية ، فقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل 10 دقائق من البدء. بعد عينات الاختبار ، أضف عنصر التحكم الإيجابي وعنصر التحكم بدون قالب.

عند إضافة الحمض النووي الريبي إلى الخلطات الرئيسية ، تأكد من إضافته إلى البئر الصحيح. استخدم خطة اللوحة للمساعدة في هذه الخطوة.

أغلق اللوحة ، وتأكد من أن الأغطية مسطحة عبر اللوحة ، وقم بتدويرها لأسفل لتجميع كل السوائل في قاع الآبار. تأكد من أن كل بئر يحتوي على نفس حجم السائل وعدم ظهور فقاعات. ثم انقل العينات إلى جهاز PCR.

افتح البرنامج ، واختر "SYBR Green" مع "تفكك". حدد الآبار المراد تحليلها ، واختر "غير معروف" كنوع العينة و "SYBR" كصبغة الفلورسنت. قم بتسمية الآبار الموجودة على تخطيط اللوحة بمعلومات العينة ، بما في ذلك ما إذا كان الاختبار مخصصا لبئر Lyssavirus أو بيتا أكتين.

انقر فوق "إعداد الملف الحراري" وقم بتعديل ظروف التدوير الحراري كما هو محدد في المخطوطة. انقر فوق "ابدأ" ، ثم اختر موقعا لحفظ الملف ، وحدد المربع لإيقاف تشغيل المصباح في نهاية التشغيل. عندما يظهر خيار البدء قبل إحماء المصباح ، انقر فوق "تشغيل الآن" ، ولكن تأكد من أن المصباح لديه أقل من 15 دقيقة للإحماء.