تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتعداد العاثيات

لتعداد العاثيات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، qPCR ، احصل على كوكتيل تفاعل qPCR يحتوي على بوليميراز Taq DNA ، والبادئات ، وثلاثي فوسفات الديوكسي نوكليوتيد - dNTPs - وجزيئات صبغ مراسل الفلورسنت في مخزن مؤقت محسن. انقله إلى آبار لوحة qPCR.

أضف العاثيات المعالجة حراريا. تطلق المعالجة الحرارية الحمض النووي للعاثيات من جزيئات العاثيات. أغلق اللوحة ، مما يمنع تبخر الخليط. قم بتحميل اللوحة في نظام qPCR ، مع ضبط ظروف ركوب الدراجات المناسبة.

يؤدي التسخين إلى درجات حرارة عالية إلى تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل إلى خيوط مفردة. كما أنه ينشط بوليميراز Taq DNA. يتسبب التلدين في ارتباط الاشعال الخاصة بالتسلسل بخيوط الحمض النووي للعاثيات التكميلية. يسمح التمديد لبوليميراز الحمض النووي Taq المنشط بإضافة dNTPs إلى نهاية 3 'من التمهيدي ، مما يمتد إلى خيط الحمض النووي المتنامي في اتجاه 5 إلى 3'.

تتكامل جزيئات الصبغة في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل حديثا ، مما يتسبب في زيادة شدة الفلورة. تضاعف كل دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل كمية الحمض النووي المستهدفة ، مما يزيد من شدة التألق.

حدد دورة العتبة ، CT ، القيمة ، التي يتجاوز فيها التألق المقاس مستوى الخلفية.

ترتبط قيمة Ct عكسيا بكمية الحمض النووي الأولية ، حيث يعادل كل جينوم عاثية جسيم واحد من العاثيات ، م