تفاعل البوليميراز المجهري لتضخيم الحمض النووي أحادي الشريطة

يستخدم Microsphere-PCR كرة صغيرة الحجم مقترنة بقليل النوكليوتيدات على سطحها ، مما يتيح التضخيم التفضيلي للحمض النووي أحادي الشريطة.

لبدء تفاعل البوليميراز المتسلسل المجهري ، خذ مزيجا تفاعليا يحتوي على خيوط DNA أحادية الشريطة ، وبادئات أمامية مع علامة نيوكليوتيدات إضافية ، وبوليميراز DNA القابل للحرارة ، و dNTPs ، والكريات المجهرية التي تعرض مجسات قليل النوكليوتيدات أحادية الشريطة.

ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري ، وقم بتشغيله في الظروف المحددة.

في الدورة الأولى ، عند درجة حرارة التلدين ، يرتبط الحمض النووي للقالب بالمسبار الموجود على سطح الكرة المجهرية بحيث يعمل الحمض النووي للقالب كخيط الإحساس. أثناء التمديد ، يمتد البوليميراز إلى الحمض النووي ، ويظل الإرسال المزدوج متصلا بالكرة المجهرية.

في الدورة التالية ، أثناء التمسخ ، ينفصل الحمض النووي للقالب عن الكرة المجهرية ، تاركا خيط المسبار مرتبطا بالسطح - يعمل كقالب لخيط جديد.

أثناء التلدين ، يرتبط التمهيدي الموسوم بخيط مضاد للحساس. في وقت لاحق ، يمدده البوليميراز لتصنيع خيط الإحساس بعلامة النيوكليوتيدات.

كرر الدورة عدة مرات لإنشاء نسخ متعددة من الحمض النووي أحادي الشريطة ، والتي تدخل في المحلول ، بينما تظل الملوثات ذات الشريطة المزدوجة متصلة.

انقل منتجات PCR إلى أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت للتحميل. قم بتحميل المنتج والعلامات في آبار مختلفة من الجل ، وافصلها باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.

يشكل الحمض النووي للقالب نطاقا باهتا منخفض الوزن الجزيئي ، بينما يؤكد النطاق المكثف عالي الوزن الجزيئي تضخيم الحمض النووي أحادي الشريطة.

احصل على ما يقرب من 25 كرة مجهرية من خلال العد المجهري باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 40X. بعد ذلك ، اجمع جميع الكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع العينات في جهاز التدوير الحراري ، وابدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل في ظل الظروف المناسبة.

يعد

جمع المادة الطافية بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل المتماثل من أهم الخطوات لأنها عملية رئيسية لتوليد الحمض النووي أحادي الخيط باستخدام الكرات المجهرية.

بعد التضخيم ، أضف ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل 6X إلى كل عينة. قم بتحميل 15 ميكرولترا من كل عينة في جل الاغاروز بنسبة 2٪. بعد ذلك ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة 35 دقيقة في 1X TAE buffer.