تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد القطرات للكشف عن مثيلة الحمض النووي في الكريات البيض

مثيلة بقايا سيتوزين الحمض النووي هي سمة مميزة للكريات البيض أو خلايا الدم البيضاء.

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد القطرات ، أو mdPCR ، بالتحديد المتزامن لمناطق الحمض النووي الميثيلية المتعددة داخل الكريات البيض.

قم بإعداد مزيج يحتوي على المخزن المؤقت للتفاعل وبوليميراز الحمض النووي والماء الخالي من النوكلياز. أضف بادئات أمامية وخلفية ومساحات التحلل المائي الفلورية الخاصة بكل منطقة مستهدفة. تتكون المجسات من مراسلين فلوروفوريين بألوان مختلفة مرتبطين بأجهزة التبريد لمنع انبعاث التألق.

أضف الحمض النووي المحول بثنائي الكبريتيت ، حيث يتم إزالة السيتوزينات غير الميثيلة إلى يوراسيل بينما تظل السيتوزينات الميثيلية دون تغيير. خلط.

املأ حقنة زجاجية بمزيج زيت ناقل وخافض للتوتر السطحي وآخر بمزيج زيت ناقل و PCR ، وقم بتوصيلها بمولد قطرات الموائع الدقيقة. يستحلب مزيج PCR المائي بالزيت الناقل إلى قطرات بحجم أقل من النانولتر. يعمل الفاعل بالسطح على استقرار المستحلب ويمنع اندماج القطيرات.

اجمع القطرات وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). داخل كل قطرة ، تؤدي درجة حرارة تغيير الطبيعة العالية إلى تغيير طبيعة الحمض النووي المزدوج الشريطة إلى حمض نووي أحادي الشريطة وينشط البوليميراز. يتم خفض درجة حرارة التفاعل ، مما يسمح بالتلدين الخاص بالموقع للبادئات والمجسات.

عندما يرتبط البوليميراز ويمتد الثنائي التمهيدي للحمض النووي ، تتضخم اليوراسيل مثل الثايمينات ، بينما تتضخيم السيتوزينات الميثيلية على شكل سيتوزينات ، مما يسمح بالتمييز بين المناطق الميثيلية وغير الميثيلية. يشق البوليميراز ويطلق المراسل من المسبار ، مما يتسبب في انبعاث الفلورة.

بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تصور القطرات تحت المجهر. يشير لون التألق إلى وجود أهداف محددة للحمض النووي الميثيلي.

لتوليد القطرات ، امزج 1 ميكرولتر من الحمض النووي المحول بالثنائي كبريتيت مع مزيج رئيسي للمسبار المحضر حديثا في أنبوب PCR ، واجمع العينة باستخدام طرد مركزي قصير. استخدم تركيبات PEEK لتوصيل أنابيب السوائل التي تستخدم لمرة واحدة بحقنتين زجاجيتين بدقة حجم 250 ميكرولتر ، واملأ مسبقا حقنة زجاجية دقيقة واحدة ب 250 ميكرولترا من الزيت الناقل الذي يحتوي على 5٪ من الفلورو الخافض للتوتر السطحي ، وحقنة زجاجية دقيقة واحدة مع 50 ميكرولترا من الزيت الناقل.

عندما يتم تحميل كلتا المحاقن ، قم بتحميل 100 ميكرولتر من مزيج PCR في حقنة الزيت الناقل ، وضع جهاز ميكروفلويديك قطرة على مسرح مجهر ضوئي عمودي مزود بكاميرا عالية السرعة.

لمراقبة وتسجيل تكوين القطرات في الوقت الفعلي ، ضع المحاقن المملوءة مسبقا على مضخة حقنة قابلة للبرمجة ، واستخدم اتحاد PEEK مع التركيبات لتوصيل أنابيب المحاقن بأنابيب قنوات المدخل الخاصة بجهاز الموائع الدقيقة بالقطرات.

ضع الأنبوب من مخرج مولد القطرات إلى داخل أنبوب PCR سعة 0.5 ملليلتر ، واضبط معدل تدفق مضخة الحقنة على 2 ميكرولتر في الدقيقة. اترك حجم القطرة يستقر قبل جمع المستحلب الناتج. اجمع المستحلب ببطء وبعناية من أعلى الأنبوب ، وانقل 75 ميكرولترا من المحلول إلى أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر لركوب الدراجات الحرارية.

بعد ذلك ، تأكد من أن محتوى الزيت في أنبوب PCR يتطابق بشكل وثيق مع حجم المرحلة المشتتة لمنع اندماج القطرات أثناء الدورة الحرارية ، ووضع الأنبوب سعة 200 ميكرولتر في التدوير الحراري.