تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القائم على الرقاقة للكشف عن متغيرات النسخ النادرة باستخدام شريحة نانو فلويد

تقنية PCR الرقمية القائمة على الرقاقة بتقسيم تفاعل واحد إلى غرف رقاقة نانوية. يتيح تضخيم التسلسلات المقسمة اكتشاف متغيرات النسخ النادرة - النصوص غير القانونية التي تحدث بتردد منخفض.

للبدء ، خذ عينة تحتوي على (كدنا) لمتغير النسخة النادرة المستهدف والمتغير الشائع. أضف محلولا يحتوي على بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة و dNTPs والبادئات.

أضف مجسات قليلة النوكليوتيدات الشائعة والنادرة الخاصة بمتغير النسخ - المصنفة بمراسلين فلوريين وجزيئات تبريدية مختلفة. يمتص المروي مضان المراسل عندما يكون على مقربة.

قم بتحميل الخليط على رقاقة الموائع النانوية. يتم تقسيم المحلول إلى غرف نانوية بحجم موحد. تعمل كل غرفة تحتوي على (كدنا) كوعاء تفاعل مستقل.

ابدأ عملية ركوب الدراجات الحرارية. تفصل درجة حرارة تغيير الطبيعة المرتفعة الحمض النووي المزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة. اخفض درجة الحرارة ، مما يسمح للبادئات ومجسات قليل النوكليوتيدات بالتلدين بالمناطق التكميلية على خيوط الحمض النووي المفردة.

قم بزيادة درجة الحرارة للوصول إلى خطوة التمديد ، حيث يمتد بوليميراز الحمض النووي التمهيدي ويشق المسبار. تتيح المسافة من جهاز التبريد انبعاث التألق للمراسل. اقرأ إشارة التألق.

قم بإنشاء مخطط مبعثر يصور الغرف مع هدف النسخ النادر المضخم والغرف الخالية من الهدف. تشير الإشارات الإيجابية للهدف إلى وجود متغير النسخة النادرة في العينة.

للبدء ، دع المزيج الرئيسي ويذوب الفحص في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ذلك ، قم بتحميل أنابيب سعة 0.5 ملليلتر مع 6 ميكرولتر من عينات (كدنا). أيضا ، قم بعمل أنبوب تحكم بدون قالب. بعد ذلك ، قم بدوامة المزيج الرئيسي برفق وتناول 8.7 ميكرولتر لكل تفاعل في أنبوب معقم.

ثم ، لكل تفاعل ، أضف 0.87 ميكرولتر من برايمر الفحص المخصص ، وأضف 1.83 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. امزج المزيج برفق ، وانقل 11.4 ميكرولتر إلى كل أنبوب يحتوي على cDNA ، وإلى عدم وجود عنصر تحكم في القالب. بعد ذلك ، امزج الأنابيب برفق وقم بتجميع محتويات الأنبوب باستخدام الطرد المركزي النبضي. للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحميل الرقائق في أسرع وقت ممكن.

قم بتوصيل محمل الرقائق ، وانتظر حتى يتحول ضوء المؤشر إلى اللون الأخضر. بعد ذلك ، قم بإعداد حقنة سائل الغاطس عن طريق سحب المكبس برفق إلى 1 إلى 2 ملم ، ثم قم بإزالة الغطاء وإضافة الحافة.

بعد ذلك ، لاحظ الكود المكتوب على غطاء شريحة جديدة ، ثم أمسك الغطاء بعناية من الجانب ، وانزع الفيلم الواقي ، وضعه في عش الغطاء مع الجانب اللاصق لأعلى. الآن ، اضغط على الرافعة لأسفل لفتح المشبك ، وقم بتحميل الشريحة بعناية في عش الرقائق.

بعد ذلك ، ضع شفرة تحميل جديدة في اللودر. ادفعها برفق للتأكد من ثباتها في مكانها. الآن ، انقل 14.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل إلى شفرة التحميل. لا تصنع فقاعات هواء ولا تحرف الشفرة. ثم اضغط على زر "تحميل" الأسود لتوزيع مستوى الصوت على الشريحة.

من المهم التأكد من أن شفرة التحميل في مكانها. بعد ذلك ، أثناء ملء الشفرة ، لا تضغط على الماصة إلى المحطة الثانية لتجنب إدخال الفقاعات. أيضا ، لا تحرف الشفرة بالحافة.

استمر باستخدام المحقنة لنقل حوالي 20 قطرة من سائل الغمر على سطح الشريحة. احرص على عدم لمس السطح بالحافة ، وقم بتغطية السطح بالكامل دون أن يفيض. بعد ذلك ، قم بتدوير ذراع الدوار لجعل الغطاء يتلامس مع الشريحة ، واضغط لأسفل لمدة 15 ثانية. ثم اضغط على زر الغطاء لتحرير الرقاقة وإعادة ذراع اللودر إلى وضع الراحة. الآن ، افتح المشبك ، وأمسك الشريحة المجمعة بزاوية 45 درجة لتوزيع سائل الغمر بعناية من خلال منفذ التعبئة عبر حقنة. بعد ذلك ، قم بتدوير الرقاقة قليلا لإزالة فقاعات الهواء ، ثم قم بإزالة أي سائل زائد بمنديل معقم.

تجنب انسكاب سائل الغمر على حدود الحافة. إذا حدث ذلك ، فقم بإزالة الفائض بعناية قبل الختم.

أخيرا ، أغلق علبة الشريحة عن طريق تقشير الملصق الموجود على الغطاء برفق ، ثم سد منفذ التعبئة لمدة 5 ثوان على الأقل. الآن ، استخدم الشريحة في غضون ساعتين ، وحتى ذلك الحين ، قم بتخزينها في الظلام.

لإعداد التفاعل ، افتح الغطاء وقم بتثبيت المحولات على كلتا الكتلتين ، حتى عند استخدام كتلة واحدة. بعد ذلك ، ضع شريحة على كتل العينة ووجه منافذ التعبئة الخاصة بها نحو مقدمة جهاز التدوير الحراري وارفع المنفذ قليلا. استخدم رقائق فارغة لموازنة الكتلتين.

بعد ذلك ، ضع الوسادة الحرارية فوق الإعداد لتغطية الرقائق بالكامل. ثم قم ببرمجة الدورات وأغلق الغطاء وابدأ التفاعل.

عندما ينتهي التفاعل ، قم بإيقاف تشغيل الدراجة الحرارية ، وإزالة الوسادات الحرارية ، ثم قم بإزالة الرقائق. دع الرقائق تذوب إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل في الظلام وقم بتحليلها في غضون ساعة. نظف سطح الرقاقة باستخدام الأيزوبروبانول أثناء فحصها بحثا عن التسريبات أو المشكلات الأخرى.

لحفظ البيانات ، أدخل شريحة ذاكرة USB في نظام الكاشف حيث يمكن حفظ البيانات. ثم افتح صينية الشرائح الخاصة بنظام الكاشف وقم بتحميل الشريحة ووجهها لأعلى. أغلق الدرج وانتظر 30 ثانية حتى تتم معالجة البيانات. ثم قم بإزالة الشريحة وكرر العملية للشريحة التالية.

بعد ذلك ، انقل محرك أقراص USB من الكاشف إلى جهاز كمبيوتر ، وانقل الملفات. افتح البرنامج المستند إلى السحابة ، ثم قم بإنشاء مشروع واستيراد جميع ملفات البيانات للرقائق ذات الأهمية. ثم ، ضمن علامة التبويب "الرقائق المحددة" ، حدد الصبغة والمقايسة المستخدمة. حدد ما إذا كانت الشريحة مقبولة من خلال تصورها في علامة التبويب "مراجعة البيانات". إذا تم تحميل العينة بشكل جيد ، فيجب أن تكون 13,000 نقطة على الأقل قابلة للاستخدام.

بعد ذلك ، انظر إلى المخطط المبعثر للشريحة المحددة. هناك ، قم بتطبيق عتبة محددة بواسطة نوع الفحص. لإشارة صبغة مراسل الفلوريسين أميديت ، استخدم عتبة 6,000. الآن ، قم بإزالة أي إشارات مشكوك فيها يمكن أن تؤدي إلى إيجابيات خاطئة. حدد البقعة المشكوك فيها على المخطط المبعثر باستخدام أداة "Lasso" وحدد خيار "غير محدد".

تشير جميع البقع الإيجابية المتبقية إلى وجود نسخ (كدنا) للهدف النادر الذي تم تحليله.