عزل البلاعم عن عقدة الجذر الظهري للفأر باستخدام التفكك الميكانيكي

العقدة الجذرية الظهرية ، أو DRG ، هي مجموعة من أجسام الخلايا العصبية على طول الحبل الشوكي التي تحمل المعلومات الحسية من الجهاز العصبي المحيطي إلى الجهاز العصبي المركزي. تسبب إصابة الأعصاب الطرفية تراكم البلاعم في DRG وتطور آلام الأعصاب.

لعزل البلاعم القابلة للحياة باستخدام طريقة خالية من الإنزيم ، خذ أنسجة DRG للفأر التي تم تشريحها حديثا في الخالط المملوء بمحلول بارد مثلج للحد من الإجهاد الخلوي. باستخدام مدقة ، قم بتجانس الأنسجة ميكانيكيا لتحرير الخلايا.

قم بالتصفية من خلال مصفاة الخلايا لإزالة كتل الخلايا والحصول على تعليق أحادي الخلية في التدفق. يحتوي تجانس الأنسجة على خلايا عصبية وخلايا غير عصبية ، والتي تشمل الضامة والمايلين العائم الحر - الغمد العازل للخلايا العصبية.

أضف المتجانس المصفى إلى أنبوب يحتوي على وسط تدرج الكثافة وجهاز طرد مركزي. تحت قوة الطرد المركزي ، تستقر الخلايا القابلة للحياة ذات الكثافة العالية للطفو في قاع الأنبوب لتشكيل حبيبات ، بينما يظل المايلين معلقا. تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت يحتوي على أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور ضد مستقبلات سطح الخلية الخاصة بالبلاعم. احتضان للمدة المطلوبة. يرتبط الجسم المضاد بمستقبله على خلايا البلاعم ، وبالتالي يقوم بتسمية سطح الخلية بالفلورسنت. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تشير إشارة التألق الخاصة بالأجسام المضادة إلى وجود البلاعم في العينة.

قبل البدء في التجربة ، قم بإعداد محلول العمل لوسط تدرج الكثافة عن طريق خلط تسعة أحجام من الوسط مع حجم واحد من الكالسيوم وخالي من المغنيسيوم 10X HBSS ، واحتفظ به على الجليد. تأكد من أن الفأر مخدر تماما بسبب عدم الاستجابة لقرصة المخلب الخلفي.

ابدأ بوضع فأر مخدر داخل غطاء دخان كيميائي في وضع ضعيف بأربعة أقدام مثبتة بشريط لاصق. استخدم الملقط لرفع الجلد أسفل القفص الصدري ، ثم باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق صغير لكشف الكبد والحجاب الحاجز. باستخدام نفس المقص ، قم بقص الحجاب الحاجز والقفص الصدري ، ثم افتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض.

بعد ذلك ، باستخدام مقص القزحية ، قم بقص الزائدة الأذينية اليمنى بسرعة. بمجرد ملاحظة النزيف ، أدخل إبرة قياس 30 في الطرف الخلفي للبطين الأيسر ، وقم بحقن 10 ملليلتر ببطء من 1X PBS المبرد مسبقا لبث.

لإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية ، ضع الفأر في وضع الانبطاح. استخدم مشرطا مقاس 11 لعمل شقين طوليين عميقين جانبيين بدءا من المنطقة الصدرية وصولا إلى المنطقة العجزية. ثم قم بإزالة الجلد الذي يعرض طبقة العضلات الظهرية. بعد ذلك ، مع Friedman-Pearson Ronger ، قم بتقشير الأنسجة والعضلات الضامة حتى تتعرض عمليات العمود الفقري القطني العجزي والعمليات المستعرضة الثنائية.

أولا ، استخدم Friedman-Pearson Rongeur لفتح العمود الفقري الظهري بعناية. بعد ذلك ، قم بالتبديل بين مقص Friedman-Pearson Rongeur و Noyes Spring Scissors لإزالة عظام العمود الفقري ، وتعريض الحبل الشوكي مع توصيل الأعصاب الشوكية السليمة. تشريح DRG القطني المماثل والمقابل بعناية.

ضعه في 1 مليلتر من الكالسيوم المثلج وخالي من المغنيسيوم 1X HBSS في خالط الأنسجة Dounce. قم بتجانس أنسجة DRG في الخالط Dounce باستخدام مدقة فضفاضة لمدة 20 إلى 25 مرة. ضع مصفاة خلية نايلون معقمة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا. استخدم 800 ميكرولتر من 1X HBSS المثلج لتبليل مصفاة الخلية.

استخدم ماصة لتجميع معلق الأنسجة المتجانسة من الخالط على مصفاة الخلية الرطبة، وجمعها في الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلترا. اشطف الخالط مرتين ب 800 ميكرولتر من 1X HBSS المثلج ، وجمع السائل في نفس الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر لزيادة المحصول.

أضف 1.5 مل من وسط التدرج المتساوي التوتر المتساوي الكثافة المثلج في أنبوب FACS معقم من البوليسترين سعة 5 مل. انقل الخلية المتجانسة من الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر إلى أنبوب FACS هذا ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل لخلط جيدا.

أضف 500 ميكرولتر إضافي من 1X HBSS لإغلاق الجزء العلوي. الطرد المركزي للخلايا عند 800 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استنشق بعناية المادة الطافية التي تحتوي على المايلين في الوسط ، دون إزعاج حبيبات الخلية في قاع الأنبوب.

أضف 100 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على 5٪ مصل بقري جنيني إلى الحبيبات ، وأعد تعليق خلايا DRG. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد لفأر ألفا CX3CR1-APC إلى الخلايا ، واحتضانه في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

اغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 ملليلتر من PBS. الطرد المركزي للخلايا عند 360 مرة جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من PBS لتحليل FACS.