عزل وتنقية الخلايا البائية من الدم المحيطي البشري

لإجراء الفصل السلبي المناعي للخلايا البائية ، اجمع الدم المحيطي البشري في أنبوب يحتوي على مضادات التخثر لمنع تخثر الدم. أضف خلايا الدم الحمراء ، كرات الدم الحمراء ، المخزن المؤقت للتحلل لتحلل كرات الدم الحمراء دون التأثير على خلايا الدم الأخرى.

جهاز طرد مركزي لترسيب خلايا الدم السليمة والأكثر كثافة من كرات الدم الحمراء الأقل كثافة ، والتي تبقى في المادة الطافية. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في وسط طازج.

انقل الخلايا إلى لوحة ثقافة. احتضان للسماح للبلاعم والخلايا الوحيدة بالالتصاق باللوحة بينما تظل الخلايا غير الملتصقة ، بما في ذلك الخلايا البائية ، معلقة.

اجمع الخلايا المعلقة في أنبوب جديد. جهاز طرد مركزي لتكسير الخلايا وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت.

أضف محلول كوكتيل يحتوي على أجسام مضادة بيوتينيل خاصة بخلايا الدم بخلاف الخلايا البائية. ترتبط الأجسام المضادة بالمستضدات الموجودة على سطح الخلايا غير البائية ، تاركة الخلايا البائية غير مسماة.

الطرد المركزي. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على أجسام مضادة غير مرتبطة.

أضف محلول من الخرز المغناطيسي المترافق بالستربتافيدين. أثناء الحضانة ، يرتبط الستربتافيدين الموجود على الميكروبيدات بإحكام بالأجسام المضادة الحيوية المرتبطة بالخلايا غير البائية ، وتشكل مجمعات.

ضع الأنبوب في مجال مغناطيسي للصق الخلايا غير البائية المرتبطة بالخرز المغناطيسي بجدران الأنبوب ، مع ترك الخلايا البائية معلقة. انقل المادة الطافية التي تحتوي على خلايا بائية نقية إلى أنبوب.

جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا البائية في وسط لمزيد من التحليل النهائي.

مباشرة بعد الحصول على عينة دم 10 ملليلتر من الوريد المرفقي المتوسط إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على EDTA المكمل بالبوتاسيوم ، قم بقلب الأنبوب عدة مرات لمنع تكوين الجلطة. بعد ذلك ، أضف 35 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء المعقمة إلى الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

عندما يمكن ملاحظة الضوء من خلال الأنبوب ، قم بالطرد المركزي للدم وتأكد من وجود حبيبات بيضاء. قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل المتبقي مع 10 ملليلتر من الأوتوكلاف إلى PBS ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من وسط RPMI 1640.

ضع الخلايا في طبق استزراع بطول 10 سم لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتدوير طبق الثقافة برفق عدة مرات وانقل الخلايا العائمة إلى أنبوب مخروطي بلاستيكي سعة 15 ملليلترا.

بعد غسلتين بالطرد المركزي ، أعد تعليق الحبيبات عند تركيز 5 إلى 10 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد PBS ، وأضف 5 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للإنسان المضاد للبيوتينيل المخصص لخلايا الدم لكل 1 × 10⁶ خلايا.

بعد حضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد ، اغسل الخلايا بحجم زائد 10 أضعاف من PBS المعقم ، وأعد تعليق الحبيبات في 5 ميكرولترات من الميكروبيدات المترافقة بالستربتافيدين لكل 1 × 10⁶ خلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة ، أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا وضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

عندما تلتصق الميكروبيدات بجدار الأنبوب ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد ، وأضف 2 ملليلتر إضافي من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا. بعد المجموعة الثانية من المواد الطافية ، اجمع الخلايا المجمعة عن طريق الطرد المركزي ، وانقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 ملليلتر في مخزن مؤقت جديد PBS بتركيز 1 × 10⁷ خلايا لكل مليلتر.