التقييم الوظيفي للخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة باستخدام اختبار ELISpot

الخلايا البائية التي تفرز الأجسام المضادة ، أو ASCs هي خلايا بائية متمايزة تفرز أنماطا متشاوية للأجسام المضادة ، بما في ذلك IgG و IgM ، لضمان الحماية من مسببات الأمراض.

لإجراء تقييم وظيفي ل ASCs في المختبر ، ابدأ باختبار بقعة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. خذ لوحة ELISpot تحتوي على غشاء فلوريد بولي فينيلدين منشط في القاعدة.

احتضان الآبار بشظايا الأجسام المضادة متعددة النسيلة التي تحتوي حصريا على مناطق Fab بدون منطقة Fc للجسم المضاد. تحتوي كل منطقة من مناطق فاب على موقع ربط لأنماط تماثلية محددة للأجسام المضادة - IgG أو IgM ، مما يتيح تحديد كلا النمطين المتماثلين.

أثناء الحضانة ، تلتصق شظايا الجسم المضاد بالغشاء ، مما يؤدي إلى الشلل.

تراكب الآبار بمحلول مانع لمنع الارتباط غير المحدد. قم بزرع اللوحة بالخلايا البائية المنشطة التي تفرز الأجسام المضادة ، واحتضنها. تفرز ASCs أنماطا متماثلة مختلفة ، بما في ذلك IgG و IgM ، والتي ترتبط بشظايا الأجسام المضادة المرتبطة بالغشاء.

اغسل اللوحة بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة المفرزة غير المرتبطة. عالج بعض الآبار بأجسام مضادة للكشف المترافق بالإنزيم ل IgM والبعض الآخر بالأجسام المضادة للكشف عن IgG ، واحتضانه.

ترتبط الأجسام المضادة للكشف بالأنماط المتماثلة الخاصة بها ، وتشكل مجمعات مناعية.

أضف ركائز لونية إلى جميع الآبار ، والتي تتفاعل مع الإنزيمات وتنتج بقعا أرجوانية اللون على الغشاء. أضف محلول إيقاف لإيقاف التفاعل.

تشير البقعة الملونة المنتجة في كل بئر إلى وجود النمط الإسوي للجسم المضاد المحدد ، والذي يرتبط بالنشاط الإفرازي للخلايا البائية.

عندما يتم حصاد جميع الخلايا ، قم بزرع المجموعات الفرعية في آبار فردية من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا بتركيز 1 إلى 10 × 10⁵ خلايا لكل مليلتر في وسط RPMI الطازج. بعد ذلك ، قم بتنشيط الخلايا البائية ب 5 ميكروغرام من CpG (ODN 2006) لكل 1 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر لكل بئر في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمسة أيام.

في نهاية التنشيط ، أضف 30 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 35٪ في الماء المقطر إلى كل بئر من ألواح ELISpot لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، استبدل الإيثانول في كل بئر ب 150 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج المعقم ، واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لإزالة الإيثانول المتبقي. قم بإجراء غسل PBS ، متبوعا بإضافة 50 ميكرولترا من جزء F (ab') 2 متعدد النسيلة من Ig المضاد للإنسان إلى كل بئر.

اغسل الأطباق مرتين باستخدام PBS ، كما هو موضح للتو. قم بسد الربط غير المحدد في كل بئر باستخدام 200 ميكرولتر من PBS الطازج مع BSA لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد سلسلة غسيل PBS أخرى ، احتضان الآبار في 100 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 الطازج عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر ELISpot بالعدد المناسب من الخلايا البائية المنشطة.

ارفع الحجم النهائي لكل بئر إلى 150 ميكرولتر مع وسط RPMI جديد. بعد ذلك ، أعد لوحة ELISpot إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 8 إلى 14 ساعة. في نهاية فترة الحضانة ، تخلص من الوسط ، واغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى Tween 20 لمدة خمس غسلات لمدة 3 دقائق.

بعد الغسيل الأخير ، أضف الأجسام المضادة المناسبة للكشف إلى الآبار المقابلة لها ، واحتضن الألواح لمدة ساعتين في الظلام. بعد سلسلة غسيل PBS أخرى ، أضف 50 ميكرولترا من ركيزة BCI / NBT إلى كل بئر لمدة 5 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

عندما تظهر بقع أرجوانية ، أوقف التفاعل ب 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لكل بئر ، واشطف اللوحة بماء الصنبور الجاري. بعد ذلك ، جفف أغشية ELISpot المحمية من الضوء في الهواء.