عزل الخلايا التائية القائم على التعويم باستخدام فرز الخلايا المنشط بالطفو

لعزل الخلايا التائية - خلايا الدم البيضاء الضرورية لجهاز المناعة - باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالطفو ، BACS ، خذ تعليقا من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، PBMCs. تحتوي PBMCs على خلايا تائية مستهدفة وخلايا غير مستهدفة مثل الخلايا البائية والخلايا الوحيدة والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا المتغصنة.

أضف عازلة تحتوي على كمية كافية من الجسم المضاد للمضادات المضادة ل CD3 البيوتينيل واحتضانها للمدة المطلوبة. يرتبط الجسم المضاد بمركب CD3 - وهو مركب بروتين متعدد المستويات على سطح الخلية - وهو سمة مميزة للخلايا التائية.

أضف فقاعات دقيقة وظيفية - جزيئات كروية صغيرة مغطاة بالستربتافيدين - للاختيار الإيجابي للخلايا التائية المرتبطة بالأجسام المضادة. جوهر كل فقاعة صغيرة عبارة عن كرة مجوفة ، مما يجعلها جزيئات منخفضة الكثافة قادرة على الطفو في محلول مائي.

احتضان الخليط تحت التحريك ، مما يسمح للفقاعات الدقيقة والعينة بالاختلاط جيدا. أثناء الحضانة ، يرتبط الستربتافيدين الموجود على الفقاعة الدقيقة بالبيوتين على الجسم المضاد المرتبط بالخلايا التائية ، مما يؤدي إلى شل حركة الخلايا الموجودة على الفقاعات الدقيقة.

الطرد المركزي الأنبوب. تنفصل الخلايا غير المستهدفة عن الخليط على شكل حبيبات في الأسفل.

تظل الفقاعات الدقيقة المرتبطة بالخلايا التائية المستهدفة واقفة على قدميها على السطح ، مما يؤدي إلى فصل الخلايا التائية القائم على الطفو. تقنية الفصل هذه تحد من الضغط على الخلايا المستهدفة. باستخدام ماصة رفيعة ، قم بإزالة الحبيبات والفرع دون إزعاج طبقة الفقاعات الدقيقة.

أعد تعليق الخلايا التائية المعزولة المرتبطة بالفقاعات الدقيقة في وسط مزرعة مناسب لمزيد من المعالجة.

للبدء ، احتضان 3 × 10⁸ PBMCs التي تم الحصول عليها تجاريا في 2.5 مل من المخزن المؤقت للفصل مع الجسم المضاد المضاد ل CD3 البيوتينيل. امزج المكونات برفق عن طريق سحب العينة ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

أضف فقاعات الستربتافيدين الدقيقة إلى الخلايا بنسبة 0.5 إلى 1 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، واخلطها باستخدام دوار تجاري من طرف إلى طرف عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي ، ستكون الخلايا المختارة إيجابيا في الجزء العلوي من المعلق مع فقاعات الستربتافيدين الدقيقة ، وستكون الخلايا المتبقية غير المحددة في حبيبات الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.

باستخدام ماصة زجاجية مقاس 9 بوصات، أدخل الطرف الموجود أسفل طبقة الخلية الفقاعية في قاع الأنبوب. قم بشفط حبيبات الخلية وsubnatant باستخدام ماصة إلكترونية ونقلها إلى أنبوب جديد.

أعد تعليق طبقة الخلية الفقاعة المتبقية في الأنبوب الأصلي في 1 مليلتر من وسط الخلية التائية الكامل. قم بالطرد المركزي للمادة الفرعية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واستخدمها للقياس غير المباشر للنقاء والاسترداد.