التعرف على علامة القرص المضغوط للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكينات البشرية عن طريق قياس التدفق الخلوي

الخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكين ، CIK ، هي مجموعات خلايا مناعية غير متجانسة يتم إنشاؤها خارج الجسم الحي من مزارع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) المحفزة بسيتوكينات محددة وأجسام مضادة وحيدة النسيلة. تتكون خلايا CIK من مجموعات الخلايا ، بما في ذلك خلايا CD3 + CD56 + NK-T ، وخلايا CD3 + CD56- T ، وخلايا CD3-CD56 + NK.

لتحديد نسبة خلية CIK ، ابدأ بأنابيب تحتوي على تعليق خلية CIK المشتق من PBMC. أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD3 و CD56 المترافقة مع الفلوروفورات المختلفة وخلوطها إلى أنابيب معينة. أضف الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل المترافقة مع الفلوروفورات المماثلة كأجسام مضادة محددة في أنابيب أخرى.

تتعرف الأجسام المضادة المضادة ل CD3 والمضادة ل CD56 المصنفة بالفلورسنت على CD3 و CD56 المعبر عنها على مجموعات خلايا CIK ، على التوالي. تفتقر الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل إلى خصوصية المستضد المستهدف ، مما يسهل قياسات إشارة الخلفية غير المحددة.

خلايا الماصة في أنابيب مستديرة القاع مع أغطية مصفاة خلوية تساعد في إزالة مجاميع الخلايا. قم بتحميل الأنابيب في دائري لمقياس التدفق الخلوي. أثناء الجري ، تمر كل خلية عبر القناة وتواجه أشعة الليزر ، مما يؤدي إلى تشتيت الضوء.

يقيس أحد الكاشفات شدة الضوء المتناثر إلى الأمام ، مما يدل على حجم الخلية ؛ يقيس آخر شدة الضوء المتناثرة الجانبية بشكل عمودي على شعاع الليزر ، مما يشير إلى حبيبات الخلية. تساعد هذه المعلومات معا في تحديد مجموعة الخلايا المناعية.

في الوقت نفسه ، تثير أشعة الليزر ذات الأطوال الموجية المحددة للإثارة الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروفور على الخلايا ، مما يتسبب في انبعاثات إشارة الفلورسنت التي يتم اكتشافها.

يحدد تحليل شدة الفلورسنت المحددة على الخلايا نسبة المجموعات السكانية الفرعية لخلايا CIK.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا CIK، كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم اغسل خلايا CIK ب 10 ملليلتر من PBS المعقم. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 مرة جم و 18 إلى 20 درجة مئوية. شفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا ب 5 ملليلتر من PBS. احسب أرقام الخلايا واختبر صلاحية الخلية باستخدام مقايسة استبعاد trypan blue.

Aliquot خلايا CIK إلى ستة أنابيب معقمة سعة 1.5 ملليلتر بكثافة تقارب 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر من PBS. قم بتسمية الخلايا ومعالجتها، كما هو مفصل في بروتوكول النص. امزج خلايا CIK برفق مع الأجسام المضادة عن طريق الماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 ملليلتر. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 300 مرة جم و 18 إلى 20 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مليلتر من PBS. بعد ذلك، قم بتحريك ماصة الخلايا برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 ملليلتر. انقل معلق الخلية إلى أنبوب دائري معقم من البوليسترين سعة 5 ملليلتر مع غطاء مصفاة خلية عن طريق سحب العينات برفق عبر الغطاء. ثم ضع الأنابيب على الرف الدائري بالترتيب.

افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وأنشئ مجلدا تجريبيا. ثم انقر فوق الزر "عينة جديدة" لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. قم بتسمية الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص.

لإنشاء نظام مبعثر لمجموعات خلايا CIK ، أولا ، حدد الأنبوب 1 وانقر فوق الزر Dot Plot لإنشاء مخطط FSC-A / SSC-A. ارسم بوابة مستطيلة فوق مجموعة الخلايا بأكملها بعتبة FSC-A أكبر من 5,000 لاستبعاد حطام الخلية.

حدد المعلمة FSC-A/FSC-H للمخطط النقطي الجديد، وارسم بوابة مضلع حول جميع الخلايا المفردة. حدد العدد مقابل مترافق FITC (CD3) والعدد مقابل APC المترافق (CD56) لرسم الرسم البياني الجديد. حدد المعلمة المترافقة FITC (CD3) مقابل APC المترافق (CD56) للمخطط النقطي الجديد ، وارسم بوابة من أربعة أرباع لتحديد المجموعات الفرعية الأربعة.

سجل البيانات من 20,000 خلية مفردة في كل عينة. انقر فوق الزر "تحميل عينة" لتحليل عينة التحكم الفارغة أولا. حدد مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.