اختبار لتحديد إفراز الإنترفيرون جاما في الأعضاء اللمفاوية الفئرانية

إنترفيرون جاما ، أو IFN-γ ، وهو سيتوكين تفرزه الخلايا التائية للخلايا الليمفاوية والخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية ، يتوسط الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض.

لدراسة إنتاج IFN-γ في الموقع ، خذ فأرا مزروعا بخلايا تائية ذات علامة فلورية مصممة للتعبير عن مستقبل يتعرف على البيضاوي - مستضد نموذجي.

خذ معلقا من البكتيريا المسببة للأمراض — معدل وراثيا لشفط البيضا الألبومي — وحقنها عن طريق الوريد في الفأر، مما يتسبب في عدوى جهازية. تصل البكتيريا المنتشرة إلى الطحال - وهو عضو ليمفاوي ثانوي - مما يساعد على إزالة مسببات الأمراض عن طريق تسهيل التفاعل مع الخلايا المناعية.

تبتلع الخلايا العارضة للمستضد البكتيريا وتعرض المستضد. ترتبط الخلايا التائية بالمستضد عبر مستقبلاته ، ويتم تنشيطها ، وتنتج IFN-γ.

تطلق خلايا البلاعم المصابة بالبكتيريا وسطاء مناعيين وتنظم الروابط المنشطة على سطحها. عند التفاعل مع هذه الإشارات ، يتم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية وإنتاج IFN-γ.

حقن مثبط نقل البروتين داخل الخلايا لتقييد إفراز IFN-γ ، مما يتسبب في تراكمه داخل الخلايا.

حصاد طحال الفأر. ثبت الأنسجة وتجميدها للمساعدة في التقسيم. باستخدام ميكروتوم التبريد ، قم بإنشاء أقسام رقيقة من الأنسجة ، وضعها على شرائح زجاجية. أضف الأجسام المضادة الخاصة بالخلايا القاتلة الطبيعية ، والتي ترتبط بعلامات السطح ، والأجسام المضادة الخاصة ب IFN γ ، والتي تلطخ IFN-γ داخل الخلايا. يتم تصنيف هذه الأجسام المضادة بفلوروفورات مختلفة.

ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري للكشف عن IFN-γ داخل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية.

تخلص من محلول التثبيت ، وأضف 5 مل من PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تحت تحريض لطيف. بعد ذلك ، استبدل PBS ب 5 ملليلتر من 30٪ سكروز واحتضانه لمدة 12 إلى 24 ساعة للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة. الآن ، يغرق العضو في الجزء السفلي من اللوحة.

لتجميد العينة ، ضع الثلج الجاف في وعاء كبير وضع وعاء أصغر بالداخل ، يحتوي على حوالي 50 مل من الميثانول النقي وبضع قطع من الثلج الجاف. جفف الطحال برفق على منديل خال من النسالة. قم بتقطير قطرة من مركب OCT في الجزء السفلي من قالب القاعدة وضع الطحال داخل القالب. احرص على عدم إنتاج أي فقاعات.

أضف ما يقرب من 1 ملليلتر من OCT على الطحال. باستخدام الملقط ، قم بإيداع القالب الأساسي على سطح الميثانول في حمام الثلج الجاف ، مع التأكد من أن الميثانول لا يلمس OCT. سوف يتكاثف OCT ويصبح أبيض عند التجميد. تذكر تجميد الأنسجة في أسرع وقت ممكن لتقليل القطع الأثرية.

التبريد ، اضبط على درجة حرارة 21 درجة مئوية تحت الصفر. قسم الأنسجة إلى السماكة المطلوبة حوالي 10 ميكرومتر. استخدم فرشاة لجمع الأقسام على شرائح المجهر الزجاجي ، وافحصها بصريا. اسمح للأقسام بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.

ارسم دائرة باستخدام مانع السوائل ، على سبيل المثال ، قلم PAP ، حول قسم الأنسجة خارج OCT. بمجرد أن يجف النسيج ، أعد ترطيب العينة عن طريق تقطير 100 ميكرولتر من PBS على قسم الأنسجة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS من القسم عن طريق الشفط ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب لكل قسم عينة. احتضن في غرفة مبللة مغطاة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

للتلطيخ بالأجسام المضادة الأولية ، استبدل محلول الحجب بمزيج الأجسام المضادة الأولية المحضرة لكل عينة. احتضن لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مبللة مغطاة ، قبل الغسيل حسب المخطوطة.

الآن ، قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية ذات الأهمية إلى التركيز الأمثل ، عادة 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر في محلول الحظر. قم بإزالة محلول الغسيل النهائي من القسم ، وأضف مزيج الأجسام المضادة الثانوية المحضرة أعلى القسم ، واحتضنه لمدة ساعة إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة في غرفة مغطاة ومبللة.

بعد الغسيل باستخدام مخزن الغسيل المؤقتة وفقا للمخطوطة ، قم بإزالة محلول الغسيل وقم بإجراء غسيل نهائي باستخدام PBS. قم بشفط المحلول الملحي المخزن بالفوسفات واترك PBS المتبقي يتبخر دون أن يجف القسم تماما.

ارسم دائرة حول القسم الموجود في الجزء الخلفي من الشريحة. بعد ذلك ، ضع قطرة من وسط التثبيت أعلى العينة ، وتأكد من أن الوسيط يغطي القسم بأكمله ، ثم ضع زجاج الغطاء بعناية في الأعلى. دع العينات تتبلمر طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

في الصباح ، ضع الشريحة تحت مجهر المسح الضوئي بالليزر الطيفي المقلوب. اضبط الأهداف على 10x / NA 0.40 ، أو 60x / NA 1.4 لتحليل توطين السيتوكينات دون الخلوية.