العزل الانتقائي للخلايا التائية CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة

γδ تعبر الخلايا التائية عن مستقبلات الخلايا التائية ، TCRs ، التي تتكون من سلاسل جاما ودلتا ذات مجالات متغيرة وثابتة.

CD4 + Vδ1 + الخلايا التائية - مجموعة سكانية فرعية للخلايا التائية γδ - تشارك في التعبير عن سلسلة Vδ1 المتغيرة والمستقبلات المشتركة CD4. تهاجر هذه الخلايا إلى الأنسجة الملتهبة وتتحول إلى خلايا CD4+ أو CD8+ αβ T ناضجة وظيفيا - مما يتوسط في الاستجابة المناعية.

لعزل الخلايا التائية CD4 + Vδ1 + من الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري ، PBMCs ، قم بإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت. استخدم كاشف حجب Fc لمنع مستقبلات Fc على سطح الخلية ومنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.

أضف الأجسام المضادة المضادة ل Vδ1 المقترنة ب FITC الفلوروفوري ، والتي ترتبط بمستضدات Vδ1 للخلايا التائية γδ. احتضان مع الميكروبيدات المغناطيسية المقترنة بالأجسام المضادة ل FITC ، والتي تلتصق بصبغة FITC على الأجسام المضادة المرتبطة بالخلايا التائية Vδ1.

مرر الخليط عبر عمود مغناطيسي لجذب الخلايا التائية Vδ1+ المرتبطة بالخرز؛ تظل الخلايا التائية Vδ1- غير مرتبطة ويتم طردها لاحقا. اغسل العمود بقوة عن طريق دفع المخزن المؤقت من خلاله لفصل الخلايا التائية Vδ1 +.

احتضان الخلايا بخرز مغناطيسي مغلف بالأجسام المضادة ل CD4 ، والتي ترتبط بمستقبلات CD4 المشتركة للخلايا. ضع الأنبوب في مغناطيس لجذب الخلايا التائية CD4 + Vδ1 + المرتبطة بالخرز. تظل الخلايا التائية CD4- Vδ1 + غير مرتبطة.

أعد تعليق الخلايا التائية CD4 + Vδ1 + في وسط. أضف كاشف منفصل للحبة لتحرير الخرزات من الخلايا. استبدل الأنبوب الموجود على المغناطيس لفصل الخرز.

اجمع المادة الطافية للخلية CD4 + Vδ1 + لمزيد من التحليل.

قبل البدء في عزل الخلايا التائية Vδ1 ، استخدم حصة 1 × 10⁶ من PBMC لتقييم تواتر الخلايا التائية الإيجابية Vδ1CD4 في عينة المتبرع عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، قم بتدوير بقية الخلايا الليمفاوية ، وأعد تعليق الحبيبات في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS لكل 1 × 10⁷ خلايا.

بعد ذلك ، قم بحظر الخلايا في 20 ميكرولترا من الكاشف الذي يحجب Fc لكل 1 × 10⁷ خلايا ، متبوعا بإضافة 10 ميكرولترات من الجسم المضاد Vδ1 المضاد للإنسان المترافق مع FITC لكل 1 × 10⁷ خلايا لمدة 12 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في 14 مل من المخزن المؤقت MACS.

أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS لكل 1 × 10⁷ خلايا ، وأضف 20 ميكرولترا من الميكروبيدات المضادة ل FITC لكل 1 × 10⁷ خلايا مع الخلط. بعد 15 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من مخزن MACS الجديد.

أثناء الطرد المركزي ، قم بموازنة عمود مغناطيسي مبرد مسبقا مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS ، وأضفها بعناية إلى أعلى العمود.

اشطف العمود بثلاث غسلات عازلة MACS سعة 500 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من المغناطيس ، واستخدم المكبس لطرد الخلايا الموجبة Vδ1 بسرعة باستخدام 1 مليلتر من المخزن المؤقت MACS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

بعد تشغيل الخلايا من خلال عمود ثان ، قم بدوامة 25 ميكرولترا من حبات CD4 لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، انقل الخرزات إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 مليلتر ، يحتوي على 1 مليلتر من المخزن المؤقت MACS ، وضع الأنبوب على مغناطيس.

بعد دقيقة واحدة ، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الخرزات في 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت لنظام MACS. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا المعزولة الإيجابية Vδ1 وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. امزج الخلايا بقوة مع الخرز. ثم ، بعد 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، مع إمالة مستمرة ، ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس.

لتجنب فقدان أي حجم للعينة ولتقليل وجود الخلايا السالبة CD4 الملوثة ، من الضروري إعادة الماصة إلى أي مخزن مؤقت متبقي من داخل الغطاء إلى القارورة.

بعد دقيقتين، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لنقل المادة الطافية المحتوية على خلية Vδ1 سالبة CD4 إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بإزالة الخلايا الإيجابية CD4 من المغناطيس ، وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.

بعد إزالة الخلايا السالبة CD4 مرتين أخريين ، كما هو موضح للتو ، احتضان الخلايا الإيجابية CD4 في 100 ميكرولتر من وسط الثقافة ، و 10 ميكرولتر من محلول فصل الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع إمالة مستمرة. في نهاية الحضانة ، أعد الخلايا إلى المغناطيس لمدة دقيقة واحدة ، واستخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لنقل المادة الطافية الخالية من الخرز Vδ1 الإيجابية CD4 الموجبة للخلية المحتوية على أنبوب جديد.

بعد إزالة أي حبات متبقية مرتين أخريين ، كما هو موضح للتو ، قم بتدوير الخلايا. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا الإيجابية ل Vδ1 CD4 في وسط جديد دافئ مسبقا للعد.