عزل شبكة الخلايا المناعية اللثوية عن كتل أسنان الفئران

تحيط اللثة ، أو أنسجة اللثة ، بجزء عنق الرحم من الأسنان وعظم الفك.

يتكون نسيج اللثة من طبقة ظهارة ، مفصولة عن النسيج الضام الأساسي بواسطة غشاء أساسي غني بالكولاجين الرابع. يحتوي النسيج الضام اللثوي على شبكة خلايا مناعية ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والخلايا البدينة والعدلات التي تحمي اللثة من العدوى.

لعزل شبكة الخلايا المناعية اللثوية ، خذ كتل أسنان الفئران التي تحتوي على أنسجة اللثة متصلة بإحكام. عالج الكتل بكوكتيل إنزيمي - يحتوي على الكولاجيناز من النوع الرابع و DNases.

تدخل الكولاجيناز إلى الأنسجة ، وتحلل الكولاجين الرابع ، وتعطل الغشاء القاعدي وظهارة اللثة ، مما يتسبب في ارتخاء اللثة من الأسنان. وفي الوقت نفسه ، تعمل DNases على تحلل ملوثات الحمض النووي. أضف عامل مخلب إلى الأنبوب. لإزالة الكاتيونات ثنائية التكافؤ ومنع تراكم الخلايا.

انقل كتل الأسنان المهضومة إلى طبق بتري يحتوي على وسط DNase. استخرج أنسجة اللثة من كتل الأسنان ، وانقلها إلى مصفاة الخلايا.

باستخدام المكبس ، اهرسي الأنسجة. يؤدي هذا التفكك الميكانيكي إلى تعطيل الطبقة الضامة اللثوية ، وإطلاق الخلايا المناعية من الأنسجة. اغسل المصفاة بالوسائط واجمع الخلايا المنبعثة في المرشح.

الطرد المركزي للمرشح ، وتكوير الخلايا ، والتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على الإنزيمات المتبقية والحطام. أعد تعليق مجموعة الخلايا التي تحمل الخلايا المناعية في وسائط كاملة ، جاهزة للتحليل المستقبلي.

تخلص من الأنسجة الزائدة من حدود اللثة ، وانقل كتل الفك العلوي والفك السفلي إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 5 ملليلتر من الكولاجيناز و DNase على الجليد. هضم الأنسجة في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA خلال الدقائق الخمس الأخيرة. ثم أضف 5 مل من وسط DNase البارد إلى الأنسجة ، واخلط محتويات الأنبوب برفق عن طريق الدوران. بعد ذلك ، انقل الكتل الأربع من الأنسجة إلى طبق بتري ، وقم بتغطيتها ب 500 ميكرولتر من وسط DNase الطازج.

استخدم مشرطا لإزالة اللثة من كل كتلة من الأنسجة ونقل محتويات الطبق بالكامل إلى مصفاة خلية 70 ميكرون فوق أنبوب سعة 50 ملليلترا. اغسل طبق بتري والمصفاة ب 3 إلى 5 ملليلتر من وسط DNase الطازج ، ثم استخدم مكبس حقنة معقمة سعة 3 ملليلتر لهرس أنسجة اللثة على شبكة المصفاة. اشطف المصفاة ب 30 إلى 35 مل من وسط DNase البارد ، وقم بالطرد المركزي للمرشح. ثم, أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل, وتحديد عدد الخلايا القابلة للحياة.