التصور داخل الحيوية للخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في دلتا جاما

الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة من دلتا جاما ، γδ IELs ، هي خلايا تائية مهاجرة متخصصة تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية جاما دلتا. توجد هذه الخلايا في الغالب داخل ظهارة الأمعاء وتقوم بدوريات في الظهارة للحد من انتقال مسببات الأمراض عبر الأمعاء.

لتصور γδ IELs داخل كائن حي ، ابدأ بفأر معدلة وراثيا مخدر مع أمعاء دقيقة مكشوفة جزئيا. يتم تعديل الفأر المعدل وراثيا للتعبير عن بروتينات المراسل - بروتينات الفلورسنت الخضراء المحسنة - حصريا في γδ IELs ، مما يتيح تتبعها.

باستخدام الكي الكهربائي ، قم بإنشاء خط ثقب فوق الأمعاء الدقيقة المكشوفة على طول السطح المعوي ، مما يمنع النزيف المفرط.

قم بعمل شق طولي فوق خط الانثقاب لكشف الغشاء المخاطي للأمعاء، مع إظهار نتوءات متعددة تشبه الأصابع — الزغابات. تحتوي كل زغابات على خلايا ظهارية مع مقيم γδ IELs تبرز في تجويف الأمعاء.

ضع الفأر مع سطح الغشاء المخاطي المكشوف مباشرة على اتصال مع صبغة الفلورسنت ، مما يضفي مضان أحمر على التجويف.

صور الماوس تحت المجهر متحد البؤر. حدد موقع الزغابات والصورة في مستويات بؤرية مختلفة على طول المحور z ، بدءا من ظهارة طرف الزغابات. اجمع بين هذه الأقسام البصرية لإنتاج صورة ثلاثية الأبعاد.

يظهر التصوير داخل الحيوية الحركة الديناميكية للفلورة الخضراء γδ IELs على طول الغشاء القاعدي للخلية الظهارية بالقرب من التجويف الأحمر.

ضع زوجين من الملقط على جانبي المساريق الأساسي بين الأوعية الدموية ، وافرك أطراف الملقط معا برفق لإحداث ثقب في الغشاء. باستخدام ملقط بزاوية وإبرة منحنية مستدقة متصلة بخيط 5 سم ، تخترق جانبا واحدا من الصفاق من خلال الفتحة الموجودة في الغشاء وأعلى من خلال الجانب الآخر من البطانة البريتونية ، مع وضع خياطة واحدة في الأعلى وأخرى بالقرب من الجزء السفلي من الشق لإغلاق الشق مع الحفاظ على حلقة الأمعاء خارجية.

لزيادة احتمالية النجاح ، لا تقم بربط أو تمزيق أي أوعية دموية أثناء وضع بنية البطن ، والحد من أي تعامل غريب مع الأمعاء.

بعد ذلك ، أغلق الجلد أسفل الحلقة المعوية بنفس الطريقة ، مع وضع خياطة واحدة في منتصف الشق بين الغرز السابقة في الصفاق الأساسي. باستخدام الكي الكهربائي ، قم بعمل خط من الثقب على طول الحدود المضادة للمساريقية ، وقم على الفور بوضع بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع تلف الأنسجة الإضافي الناجم عن الحرارة.

امسح ب Kimwipe لإزالة الماء المتبقي. استخدم مقص Vannas لقطع شق أفقي يبلغ طوله حوالي 1.5 سم عند الحافة البعيدة للنسيج المقوي ، على طول الخط المقوي باتجاه الطرف القريب من جزء الأنسجة الخارجية. عندما ينكشف سطح الغشاء المخاطي ، قم بتغطية البطن ب Kimwipe رطب للحفاظ على رطوبة الأنسجة.

لتصوير الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار ، انقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى. قم بتشغيل برنامج التصوير ، وقم بإمالة رأس المجهر للخلف ، وأضف 150 ميكرولترا من 1 ميكرومولار الأسطول AlexaFluor صبغة في محلول هانك الملحي المخزن إلى الجزء السفلي المنزلق من الغطاء الزجاجي. ضع الماوس بحيث يلامس السطح المخاطي المفتوح الغطاء مباشرة.

ضع الماوس والطبق على مرحلة التصوير في حاضنة دافئة مسبقا. اضبط شدة الإثارة ووقت التعرض لكل ليزر على ما لا يزيد عن 10 إلى 15 مللي واط ، و 120 إلى 150 مللي ثانية على التوالي ، واضبط متوسط الإطار على "2".

قم بتشغيل وظيفة كسب مضاعفة الإلكترون لتقليل ضوضاء الخلفية ، وحدد معايرة الهدف 63X لضمان القياس الصحيح لحجم البكسل. باستخدام الليزر 405 نانومتر والهدف الهوائي 20x ، قم بتصور النوى يدويا لتحديد مجال الزغابات الذي يفتقر إلى الحركة أو الانجراف الملحوظ ، وتجنب مناطق الحركة الاصطناعية بسبب التنفس أو التمعج أو نبضات القلب.

باستخدام مسح XY ، سجل إحداثيات xy لمجال الاهتمام ، وقم بالتبديل إلى هدف غمر الجلسرين 63X. احصل على صورة حية على القناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى دقيقة واحدة للتأكد من أن الزغابات في الحقل المحدد مستقرة ، مع ضبط التركيز للعثور على المستوى المتعامد أسفل الطرف الزغبي مباشرة.

بعد ذلك ، احصل على مكدسات Z بدءا من أسفل ظهارة الطرف الزغبي مباشرة ، حوالي 15 إلى 20 ميكرومتر ، وصولا إلى الزغابات ، حتى يصعب حل النوى باستخدام خطوات 1.5 ميكرومتر. بعد 3 إلى 5 دقائق من بدء الاستحواذ ، تأكد من استقرار الصورة ، وحركة خلية جاما دلتا داخل الظهارة ، واستمر في الحصول على الصور لمدة 30 إلى 60 دقيقة لكل حقل من الزغابات.