تقنية في المختبر للتمييز بين الخلايا التائية المساعدة التي تنتج GM-CSF عن الخلايا التائية الساذجة

عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم ، يتم إفراز GM-CSF بواسطة مساعد T المنتج للمعدلة وراثيا السائل الدماغي النخاعي أو خلايا T_HGM. تظهر هذه الخلايا تعبيرا منخفضا عن السيتوكينات الأخرى الخاصة بالخلايا التائية المساعدة.

لبدء التمايز في المختبر لخلايا_THGM ، خذ معلق الخلايا التائية المساعدة - معزول من طحال الفأر - يحتوي على خلايا ناضجة نشطة بالمستضد وخلايا ساذجة غير متمايزة.

أضف الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية التي تستهدف علامات السطح المميزة للخلايا الساذجة والناضجة. قم بإجراء فرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة لعزل الخلايا التائية الساذجة.

ضع الخلايا في طبقة مغلفة جيدا بالأجسام المضادة التي ترتبط بمركب مستقبلات الخلايا التائية. أضف جسما مضادا يرتبط بالمستقبلات التحفيزية المشتركة. الارتباط التآزري ينشط الخلايا.

أضف إنترلوكين 7 — السيتوكين — مما يؤدي إلى التمايز في خلايا_{TH GM}وإنتاج GM-CSF. أضف أسيتات فوربول ميريستات، PMA — مركب مؤيد للالتهابات، الأيونومايسين — أيونوفور الكالسيوم، ومثبط لنقل البروتين.

يدخل PMA الخلية وينشط بروتين كيناز. ينقل الأيونومايسين المنفذ للغشاء أيونات الكالسيوم داخل الخلية - مما يرفع تركيز الكالسيوم داخل الخلايا.

تنشيط بروتين كيناز وارتفاع مستوى الكالسيوم إشارات تعيد تحفيز خلايا_{TH H}GM - مما يؤدي إلى زيادة إنتاج GM-CSF. يمنع مثبط نقل البروتين إفراز GM-CSF ، مما يساعد على الكشف داخل الخلايا.

قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي ، والكشف عن السيتوكينات داخل الخلايا ، وتحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تشير غالبية الخلايا التي تظهر مستويات عالية من GM-CSF ولكن التعبير المنخفض عن السيتوكينات الأخرى تشير إلى التمايز الناجح في خلايا_{TH GM}.

لعزل الخلايا التائية الإيجابية CD4 ، أعد تعليق حبيبات خلايا الدم البيضاء في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لعزل الخلايا ، وقم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة 30 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر لإزالة أي حطام. بعد العد ، أعد تعليق الخلايا عند 1 × 10⁷ خلايا لكل 90 ميكرولتر من تركيز المخزن المؤقت ، وأضف 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق المضاد ل CD4 لكل 1 × 10⁷ خلايا لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، مع الخلط كل 5 دقائق.

أثناء احتضان الخلايا ، ضع عمود فصل على حامل مغناطيسي ، وقم بترطيب العمود مسبقا ب 2 مل من العازلة. ثم اغسل الخلايا ب 5 ملليلتر من العازلة وأعد تعليق الحبيبات في 1 مليلتر من العازلة. قم بتحميل العينة على العمود ، واجمع الكسر السالب CD4 في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

عندما تمر جميع الخلايا عبر العمود ، اغسل الخزان ثلاث مرات باستخدام 1 مليلتر من المخزن المؤقت لكل غسلة قبل أن يجف. بعد الغسيل الأخير ، انقل العمود إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، واغمر العمود ب 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الخلية لطرد جزء الخرزة الموجب. ثم اجمع الخلايا الإيجابية CD4 عن طريق الطرد المركزي.

لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة للخلايا التائية الساذجة ، أعد تعليق حبيبات الخلية الإيجابية CD4 التي تم فرزها بالخرز في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، واخلط الخلايا بكوكتيل مناسب للأجسام المضادة المترافقة مع التألق. بعد 20 إلى 30 دقيقة على الجليد ، محمي من الضوء ، اغسل الخلايا في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت الطازج ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من العازلة الطازجة.

قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة من النايلون ، وانقل الخلايا إلى أنبوب FACS مشفر مسبقا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت. بوابة لتحديد مجموعات الخلايا المرتفعة CD4 الإيجابية و CD25 السلبية و CD44 منخفضة CD62. بعد ذلك ، قم بفرز كسور الخلايا التائية الساذجة الإيجابية CD4 ، والسلبية CD25 ، و CD-44 المنخفضة ، و CD-62 ، إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلتر وحبيبات الخلايا التائية الساذجة الموجبة CD4 عن طريق الطرد المركزي.

بالنسبة لعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والضامة ، أو GM-CSF ، تمايز الخلايا التائية المساعدة ، قم بإعادة تعليق الخلايا التائية المصنفة عند تركيز 1 × 10⁶ خلايا لكل مليلتر في وسط RPMI كامل يحتوي على 50 ميكرومولار بيتا ميركابتو إيثانول ، واستنشاق الجسم المضاد لإبسيلون المضاد ل CD3 من كل بئر من صفيحة 48 بئرا مشفرة مسبقا.

بعد ذلك ، قم بزرع 2.5 × 10⁵ خلايا في كل بئر جنبا إلى جنب مع IL-7 ، ومضاد CD28 ، ومضاد ل IFN gamma ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الثالث من الثقافة ، استخدم المجهر للتحقق من تمايز الخلايا ، وحصاد الخلايا للطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI كامل طازج لغسلتين ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مليلتر من الوسط الكامل الطازج بعد الغسيل الثاني للعد. قسم الخلايا إلى ثلاثة أحجام متساوية ، وأعد تحفيز الحصة الأولى للخلايا التي تحتوي على PMA والأيونوميسين في وجود مثبط لنقل البروتين لمدة 4 إلى 6 ساعات.

في نهاية التحفيز ، قم بحصاد الخلايا لتلوينها بالجسم المضاد المضاد ل CD4. بعد 30 دقيقة ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من مخزن التثبيت لمدة 20 إلى 60 دقيقة ، متبوعا بغسلتين في 1 مليلتر من مخزن النفاذية لكل غسلة. ثم ، وصمة عار للتعبير عن السيتوكين داخل الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام.