العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة جرو الفأر

تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة - الضامة المقيمة في الدماغ - عن CD11b ، وهو إنتجرين على سطح الخلية.

لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من أدمغة جرو الفأر ، خذ شظايا المخ في أنابيب تفكك تحتوي على عازلة مع غراء ، وإنزيم محلل للبروتين ، ومنقوص الأكسجين ريبونوكلياز.

ضع الأنابيب على جهاز فرز ميكانيكي. أثناء الجري ، يعطل المنفصل الأنسجة ميكانيكيا.

يهضم غراء المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، ويطلق الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، في حالة تعليق. يحلل ديوكسيربونوكلياز الحمض النووي الحر في المعلق ، مما يمنع عزل الخلايا غير الفعال.

الطرد المركزي. أكمل التفكك الميكانيكي عن طريق سحب العينات. انقل المعلق من خلال مصفاة خلية لإزالة الحطام وكتل الخلايا ، والحصول على مجموعة متجانسة من خلية واحدة.

احتضان مع الميكروبيدات المغناطيسية الفائقة التي تعمل بالأجسام المضادة ل CD11b. ترتبط الميكروبيدات على وجه التحديد ب CD11b على الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة.

ما بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على حبات غير مقيدة. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت. قم بالتحميل على عمود يوضع على فاصل مغناطيسي. يتكون العمود من مصفوفة مع حبات مغناطيسية.

عند وضعها على الفاصل ، تعمل الكرات الموجودة داخل العمود على تضخيم المجال المغناطيسي ، وتحتفظ بخلايا CD11b + المرتبطة بالميكروبيدات داخل العمود ، بينما تتدفق الخلايا الأخرى من خلالها.

قم بإزالته من الفاصل واستخدم المخزن المؤقت لمسح خلايا CD11b + من العمود. الطرد المركزي للتعليق وإعادة تعليق خلايا CD11b + في وسط دبقية صغيرة.

الخلايا المعزولة جاهزة لمزيد من التحليل.

تحضير خليط التفكك حسب هذا الجدول. انقل 12 قطعة دماغية إلى أنبوب C بوزن إجمالي يبلغ 1.2 جرام لكل أنبوب تفكك. ثم ضع الأنابيب C على جهاز الفصل مع التسخين. ابدأ برنامج NTDK المحسن في المفكك. جهاز طرد مركزي لمدة 20 ثانية. أكمل التفكك الميكانيكي عن طريق سحب العينات ثلاث مرات.

انقل الخلايا إلى أربعة أنابيب سعة 15 مليلتر مع مصافي متصلة. شطف المصافي مع 10 ملليلتر من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية بماصة سعة 10 ملليلتر. بعناية ، أضف 10 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، وأعد تعليق الحبيبات. مرة أخرى ، جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات مع 6 مل من المخزن المؤقت للفرز. كرر الطرد المركزي ، وتخلص من المادة الطافية. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول CD11b-microbead ، واحتضن الأنابيب لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة ، أعد تعليق الحبيبات ب 6 ملليلتر من عازلة الفرز. كرر الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات ب 8 ملليلتر من عازلة الفرز.

بعد ذلك ، اتبع برنامج POSSEL على الفاصل لإعداد ثمانية أعمدة. مرر الخلايا عبر العمود عن طريق إضافة 1 مليلتر من تعليق الخلية في المرة الواحدة. مع 1 ملليلتر من المخزن المؤقت للفرز ، قم بمسح الخلايا الإيجابية CD11b على لوحة شطف معقمة. تجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلترا.

جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق الحبيبات ب 10 ملليلتر من وسط الخلايا الدبقية الباردة. عد الخلايا الموجبة CD11b. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الدبقية الصغيرة الباردة للحصول على تركيز نهائي من 650.000 إلى 700.000 خلية لكل ملليلتر.