تقنية لزراعة الخلايا العصبية في الحصين الفأر

خذ الحصين جرو الفأر المحصود في منطقة عازلة.

قطع الحصين إلى أجزاء أصغر ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل.

اغسل الأنسجة بالعازلة. بمجرد أن تستقر الشظايا ، قم بإزالة المخزن المؤقت. الآن ، أضف المخزن المؤقت الطازج والتربسين.

أثناء الحضانة ، يهضم التربسين ، وهو إنزيم محلل للبروتين ، المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، مما يؤدي إلى إرخاء الخلايا العصبية في الحصين.

اغسل الأنسجة المهضومة بمحلول عازل.

بمجرد أن تستقر الشظايا ، قم بإزالة المخزن المؤقت. أضف عازلة جديدة وماصة الأنسجة بشكل متكرر لفصلها ميكانيكيا ، والحصول على تعليق أحادي الخلية.

بمجرد أن يستقر النسيج غير المهضوم ، انقل معلق الخلية إلى أغطية مطلية ب poly-L-lysine مع دعامات الشمع داخل صفيحة مزرعة تحتوي على وسائط.

ترتبط الخلايا بالأسطح المطلية ب poly-L-lysine من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية.

الآن ، ضع الغطاء الملتصق بالخلايا العصبية المتجهة لأسفل في طبق يحتوي على الخلايا الدبقية القشرية أو غير العصبية في وسائط خالية من المصل.

في الثقافة ، تمنع دعامات الشمع الاتصال المباشر بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، مما يخلق بيئة مكروية حيث تعزز العوامل التي تفرز الخلايا الدبقية بقاء الخلايا العصبية ونضجها.

للبدء ، قم بتشريح ستة إلى ثمانية حصين من الجراء بعد الولادة ، البالغة من العمر يوما واحدا مع HBSS المتوسطة في طبق بتري. يقطع الحصين بمقص التشريح إلى قطع أصغر ، وينقل من الطبق إلى أنبوب سعة 15 مل. اغسل الحصين مرتين ب 5 ملليلتر من HBSS ، واتركه في 4.5 مل من HBSS بعد الغسيل.

أضف 0.5 مل من 2.5٪ من التربسين إلى 4.5 مل من HBSS ، واحتضن في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع قلب الأنبوب كل 5 دقائق. يجب أن يصبح الحصين المهضوم جيدا لزجا ويشكل مجموعة. إذا لزم الأمر ، قم بتمديد عملية الهضم لمدة 5 دقائق أخرى.

اغسل الحصين باستخدام HBSS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل ، أضف 2 مل من HBSS ، وقم بماصة الحصين لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة باستور 15 مرة. قم بترتيشر الأنسجة بماصة باستور مصقولة بالنار 10 مرات ، واترك الأنبوب لمدة خمس دقائق حتى تثبت جميع القطع في الأسفل. كرر التجربة مع القطع المتبقية حتى يختفي معظمها.

بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة سعة 1 مليلتر لنقل المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا العصبية المنفصلة برفق إلى أطباق الطلاء. أضفه مباشرة إلى وسط الطلاء المحتضن مسبقا ورج الطبق برفق. بعد 2 إلى 4 ساعات من البذر ، تحقق من أطباق الطلاء بمجهر ضوئي. يجب أن تكون غالبية الخلايا العصبية قد تعلق على الغطاء.

باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، اقلب الغطاء إلى أطباق تغذية الخلايا الدبقية التي تحتوي على وسط ثقافة عصبية مكيف مسبقا مع توجيه جانب نقطة الشمع لأسفل. يمكن أن تنمو الخلايا العصبية في أطباق تغذية الخلايا الدبقية لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتغذية الخلايا العصبية كل سبعة أيام ب 1 مليلتر من وسط ثقافة الخلايا العصبية الطازجة.