زراعة الخلايا العصبية المثيرة الفلورية من دماغ جرو الفأر المعدل وراثيا

خذ دماغ جرو الفأر المعدل وراثيا.

قم بإزالة المخيخ وتشريح الدماغ. افصل الأنسجة القشرية والحصين التي تحتوي على الخلايا العصبية المثيرة التي تعبر عن البروتين الفلوري.

انقل الأنسجة إلى لوحة ثقافة تحتوي على عازلة.

افرم الأنسجة وانقلها إلى أنبوب يحتوي على غراء.

يهضم غراء المصفوفة خارج الخلية للأنسجة ، مما يؤدي إلى تخفيف الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية.

انقل الأنسجة المهضومة إلى أنبوب به بروتينات BSA ، مما يوقف النشاط الأنزيمي ويمنع تلف الخلايا.

فصل الأنسجة ميكانيكيا ، وإطلاق الخلايا.

جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية التي تحتوي على الحطام والإنزيمات.

أعد تعليق الخلايا في وسط عصبي منخفض التألق وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية ، وإزالة مجاميع الخلايا.

قم بإجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لتحديد وفرز الخلايا العصبية الفلورية.

انقل الخلايا العصبية المصنفة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وجهاز الطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا العصبية في الوسائط العصبية.

الخلايا العصبية للبذور على أغطية مطلية ب poly-L-lysine في صفيحة متعددة الآبار. تلتصق الخلايا العصبية بالأسطح المطلية.

أضف الوسائط العصبية. احتضان لتسهيل نمو الخلايا العصبية.

أولا ، قم بتشريح المخيخ وفصل نصفي الكرة الأرضية. بعد ذلك ، افصل الحصين والقشرة بعناية عن كل نصف كرة الأرضية. انقل الأنسجة المقطعة إلى طبق بتري مقاس 35 ملم يحتوي على مخزن مؤقت لزراعة الخلايا المبردة.

بعد ذلك ، انقل الحصين والقشرة المقطعين إلى غطاء طبق بتري آخر مقاس 35 ملم. باستخدام الحافة المسطحة لشفرة المشرط ، قم بتقطيع الأنسجة بعناية بحركة متقاطعة حتى تبقى قطع صغيرة فقط.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة المفرومة بكمية صغيرة من محلول غراء من غطاء طبق بتري إلى أنبوب غراء معقم. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. بعد حضانة غراء ، انقل أنبوب غراء معقم وأنابيب BSA المعقمة إلى خزانة التدفق. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور سعة 1 ملليلتر لنقل الأنسجة القشرية الحصينية فقط من أنبوب غراء إلى أنبوب BSA 1.

من أجل تفتيت أي كتل كبيرة من الأنسجة ، قم بتقطيع الأنسجة عدة مرات باستخدام ماصة باستور سعة 1 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بترتيبات الأنسجة سبع مرات باستخدام ماصة باستور ذات الطرف الرفيع. بعد 30 ثانية ، انقل 1 مليلتر من المحلول السفلي والأنسجة من أنبوب BSA 1 إلى أنبوب BSA 2.

قم بإخراج الأنسجة في أنبوب BSA 2 عدة مرات باستخدام ماصة باستور ذات الطرف الرفيع. بعد التجربة ، انقل 1 ملليلتر من الأنسجة السفلية في المحلول من أنبوب BSA 1 إلى أنبوب BSA 3. ثلاثي الأنسجة في أنبوب BSA 3 عدة مرات.

بعد التجربة ، انقل جميع المحاليل والأنسجة من الأنبوبين 2 و 3 إلى أنبوب BSA 1. ثلاثي 2 إلى 3 مرات أخرى وجهاز طرد مركزي عند 3,000 مرة جم لمدة 3 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الأنسجة المحببة وأعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 في 2 مل من وسط السبات الكامل منخفض الفلورة. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة 20 مرة لضمان إعادة التعليق الكامل لمحلول الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بتصفية معلق الخلية من خلال منخل خلية 30 ميكرومتر في أنبوب عينة البوليسترين. قم بإعداد أنابيب تجميع فرز الخلايا عن طريق سحب 300 ميكرولتر من وسائط Hibernate A الكاملة إلى العدد المطلوب من أنابيب البولي بروبلين.

لكل نوع من أنواع الخلايا الفلورية المراد فرزها ، اختر مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة. قم بإثارة البروتين الوريدي باستخدام الطول الموجي للإثارة 488 نانومتر واكتشف الضوء المنبعث من خلال 530 أكثر من 40 مجموعة مرشح انبعاث.

قم بإثارة بروتين TdTomato باستخدام الطول الموجي للإثارة 531 نانومتر واكتشف الضوء المنبعث من خلال 575 أكثر من 30 مجموعة مرشح انبعاث. للحصول على نقاء عال ، قم بفرز الخلايا الفلورية ذات العلامات الزاهية. بعد فرز الخلايا ، انقل الخلايا المجمعة إلى أنابيب طرد مركزي مستديرة القاع سعة 2 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3,000 مرة جم لمدة 3 دقائق لتشكيل حبيبات خلية.

أعد تعليق حبيبات الخلية بالكمية المطلوبة من وسط NBA الكامل الدافئ مسبقا لتحقيق كثافة خلية تبلغ 1,000 خلية لكل ميكرولتر. للتأكد من وجود خلايا منفصلة ، افحص محلول الخلية تحت المجهر باستخدام عدسة موضوعية 4x أو 10x. قبل طلاء الخلايا ، قم بالدوامة بسرعة متوسطة لمدة 2 إلى 3 ثوان لضمان تعليق الخلية بشكل متساو.

بعد الدوامة ، قم بسحب 10 ميكرولترات من تعليق الخلية بسرعة إلى وسط كل غطاء. بعد ساعة واحدة ، قم بتغذية الخلايا ب 500 ميكرولتر من وسط NBA الكامل الدافئ مسبقا والعودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.