تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام سقالة مسامية

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على ملحق مسامي يحمل سقالة من البوليسترين تمتلك بنية مسامية ثلاثية الأبعاد.

أضف الإيثانول لإعادة ترطيب السقالة واغسلها بالوسط.

أدخل وسيطا يحتوي على بروتين مصفوفة خارج الخلية ، اللامينين. احتضن للسماح لللامينين بتغطية السقالة.

زرع الخلايا الجذعية العصبية البشرية في وسط عصبي يحتوي على عوامل نمو على السقالة المغلفة بالصفحة.

احتضان للسماح بهجرة الخلايا الجذعية إلى السقالة المسامية حيث يعزز اللامينين التصاق الخلية بالسقالة.

تستخدم الخلايا عوامل النمو وتتكاثر داخل هذه السقالة.

أضف وسيطا عصبيا خاليا من عامل النمو واستبدل الوسط المستهلك بانتظام للحفاظ على بقاء الخلية.

يحفز عدم وجود عوامل النمو تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا سلفية عصبية.

بمرور الوقت ، تستطيل العمليات العصبية لهذه الخلايا السلفية ، مما يسمح بنمو الخلايا متعددة الاتجاهات وتشكيل ثقافة ثلاثية الأبعاد.

أعد ترطيب السقالات عن طريق إضافة 2 مل من الإيثانول 70٪ ، المحضرة باستخدام الماء للري إلى كل بئر من لوحة Alvetex المكونة من 12 بئرا. تجنب لمس السقالات عن طريق توزيع 70٪ من الإيثانول أسفل جدار كل بئر. استنشق الإيثانول بنسبة 70٪ بعناية واغسل السقالات على الفور ب 2 مل لكل بئر من DMEM F12 لمدة دقيقة واحدة.

كرر إجراء الغسيل مرتين. استنشق DMEM F12 بعناية بعد الغسيل النهائي. قم بتغطية السقالات بإضافة 2 مل من اللامينين في DMEM F12 إلى كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ساعتين على الأقل.

بعد ذلك ، اغسل الطبق ب DMEM F12 الدافئ. قم بزرع كل سقالة بحوالي 500,000 خلية جذعية عصبية بشرية أو HNSCs بحجم 150 ميكرولتر من وسط RMM مع عوامل النمو. احتضان اللوحة لمدة ثلاث ساعات للسماح للخلايا بالاستقرار في السقالات.

بعد ثلاث ساعات ، أضف 3.5 مل من RMM إلى كل بئر ، مع الحرص على عدم إزاحة الخلايا من السقالات. احتضن الطبق لمدة سبعة أو 21 يوما. استبدل الوسيط بعد يوم واحد ، وهو التغذية الأولى ، واستبدل الوسط مرة أخرى بعد 2 إلى 3 أيام من الرضاعة الأولى.