توليد الخلايا العصبية الودية بعد العقدة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

خذ صفيحة دقيقة مطلية بمصفوفة خارج الخلية وأضف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المعلقة في وسط تمايز.

الوسيط على جزيئات إشارات تؤثر على مسارات الإشارات الخلوية ، وتوجه التمايز إلى خلايا السلف العصبية.

أدخل وسيطا تمايزا آخر يحتوي على جزيئات الإشارات التي تحفز التمايز إلى خلايا القمة العصبية ، أو NCCs ، السلائف للخلايا العصبية وغير العصبية.

أضف الإنزيمات لتعطيل المصفوفة ، وبالتالي فصل الخلايا.

اغسل لتحييد الإنزيمات ، ثم جهاز الطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق NCCs في وسط كروي وانقلها إلى صفيحة دقيقة.

تؤدي عوامل نمو الوسط والجزيئات الصغيرة إلى تكوين كروي.

مكمل بحمض الريتينويك, الذي يعزز التمايز إلى الخلايا العصبية السلفية السمبثاوي.

انقل الكروية إلى صفيحة دقيقة مطلية بالبروتين الالتصاق في وسط نضوج الخلايا العصبية المتعاطفة ، مما يتسبب في الارتباط الكروي.

تعمل عوامل النمو العصبي وحمض الريتينويك في الوسط على تعزيز النضج إلى الخلايا العصبية الودية بعد العقدة ، والتي تعد جزءا من الجهاز العصبي المحيطي وتنظم العمليات اللاإرادية.

قبل يوم واحد من تحريض التمايز ، قم بتغطية العدد المناسب من الألواح المكونة من ستة آبار بملليلترين من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر ، وقم بتخزين الألواح عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بتسخين الأطباق إلى درجة حرارة الغرفة ، واغسل مزرعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الجاهزة للتقسيم مرتين باستخدام PBS طازج لكل غسلة.

بعد الغسيل الثاني ، عالج الخلايا بسبعة ملليلتر من 0.5 ملليمولار EDTA لمدة 15 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، قبل شفط الخلايا الجذعية البشرية العائمة متعددة القدرات ونقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

أضف حجما متساويا من PBS إلى الأنبوب لتخفيف EDTA ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط التمايز في اليوم 01. قبل إضافة حجم مناسب من الوسط للعد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 1.25 × 10⁵ خلايا لكل سنتيمتر مربع بتركيز ملليلترين من وسط التمايز لكل بئر.

استنشق كل محلول مصفوفة الغشاء القاعدي من كل بئر من الصفيحة المكونة من ستة آبار المعدة مسبقا. ثم قم بزرع 2 مل من الخلايا في كل بئر ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، قم بتغذية الخلايا ب 3 ملليلتر من وسط التمايز في اليوم 01 لكل بئر.

في اليوم الثاني من التمايز ، قم بتغذية الخلايا بثلاثة ملليلتر من اليوم الثاني إلى العشرة وسط تمايز لكل بئر. ثم قم بإطعام الخلايا كل يومين حتى اليوم 10. لتجميع خلايا القمة العصبية إلى كرويات ، في اليوم 10 ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وأضف ملليلترين من وسط التفكك إلى كل بئر. بعد 20 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، انقل الخلايا العائمة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وارفع حجم التعليق في الأنبوب إلى 50 مل مع PBS الطازج.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في حجم كاف من اليوم 10 إلى 14 وسط كروي للعد. بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى 5 × 10⁵ خلايا لكل تركيز 500 ميكرولتر باستخدام اليوم من 10 إلى 14 وسط كروي ، ولوحة 500 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من لوحة 24 بئرا منخفضة للغاية. ثم أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا.

للحث على الحد الأدنى من الثقافة الكروية ، في اليوم 11 من الثقافة ، قم بتغذية القمة الكروية العصبية ب 500 ميكرولتر إضافي من اليوم من 10 إلى 14 وسط كروي لكل بئر. في اليوم 12 ، قم بإمالة اللوحة لتجميع الكرات على جانب واحد من اللوحة ، واستنشق بعناية أكبر قدر ممكن من الوسط من كل بئر دون شفط الكرويات. ثم قم بتغذية الكرويات بمليلتر واحد من اليوم من 10 إلى 14 وسط كروي لكل بئر.

للحث على ثقافة كروية موسعة في اليوم 15 ، قم بإطعام الكرات ب 1.5 مل من اليوم من 10 إلى 14 وسط كروي مكمل بحمض الريتينويك 0.5 ميكرومولار لكل بئر. ثم أعد الكرويات إلى حاضنة زراعة الخلايا.

لتمايز الخلايا العصبية الودية في اليوم 14 أو 28 ، قم بإمالة اللوحة لتجميع الكرات على جانب واحد من اللوحة ، وشفط بعناية أكبر قدر ممكن من الوسط. تغذية الخلايا بملليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية الودي.

لتقسيم المجاميع الكروية الكبيرة إلى كرويات أصغر ، لا تضف أكثر من ملليلتر واحد من الوسط لكل بئر ، وقم بتقطيع الماصات الكروية من خمس إلى 10 مرات قبل الانقسام.

وقم بإزالة فيبرونيكتين اللامينين الزائد من ألواح 24 بئرا المعدة مسبقا. قم بتقسيم اللوحة ملليلترا واحدا من الكرويات من كل بئر على صفيحة الثقافة الكروية المكونة من 24 بئرا بين أربعة آبار منفصلة من الصفيحة المكونة من 24 بئرا المطلية حديثا. أضف 250 ميكرولترا من وسط الخلايا العصبية الودية الطازجة إلى كل بئر ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. في صباح اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر بمليلتر واحد من وسط الخلايا العصبية الودية المكمل بحمض الريتينويك 0.125 ميكرومولار ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلية. بعد اليوم 35 ، قم بتغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال نصف الوسط الموجود في كل بئر بعناية بوسط جديد.