توليد العضيات الدماغية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية

خذ مستعمرات من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو iPSCs ، المزروعة على مصفوفة داعمة.

أضف محلولا يحتوي على إنزيمات لفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة.

انقل الخلايا إلى أنبوب ، وقم بطردها المركزي ، وتخلص من المادة الطافية.

إعادة تعليق iPSCs في وسط النمو.

انقل الخلايا إلى صفيحة دقيقة تحتوي على ألياف بوليمر متوافقة حيويا.

أجهزة الطرد المركزي لتجميع iPSCs بالقوة, تشكيل الأجسام الجنينية, أو EBs, على سقالة البوليمر.

الانتقال إلى وسيط الحث العصبي الذي يعزز انتشار iPSC والتمايز إلى الخلايا الجذعية العصبية, الخلايا السلف, والخلايا العصبية غير الناضجة.

عند الحضانة ، تخضع الخلايا للتنظيم الذاتي.

ضع الأجسام الجنينية على ورقة مدملة وأضف قطرات تحتوي على بروتينات مصفوفة خارج الخلية.

احتضان لترسيخ المصفوفة ، وتضمين EBs.

انقل EBs إلى صفيحة دقيقة تحتوي على وسيط صيانة عصبي. حضن.

تخضع EBs للتكاثر الخلوي لتشكيل نتوءات وتبرعم وتتمايز إلى خلايا عصبية ناضجة ، وتشكل عضيات دماغية.

استنشق الوسط بماصة ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية ، أو 0.5 مللي مولار EDTA ، لفصل المستعمرات ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 إلى 5 دقائق. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من وسائط E8 الطازجة إلى كل بئر ، وقم بالماصة برفق لفصل جميع الخلايا.

انقل تعليق الخلية بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي مقاس 15 ملم ، وأضف 1 مليلتر آخر من وسائط E8 الجديدة. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 290 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مليلتر من وسائط E6 ، مكملة بمثبط ROCK 50 ميكرومولار ، وعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.

قم بإعداد تعليق خلوي لكثافة الجلوس المطلوبة في وسائط E6 ، مع استكمال مثبط ROCK. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة التثبيت المنخفضة للغاية المكونة من 96 بئرا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 290 جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتجميع الخلايا بالقوة. بعد ذلك ، قم باحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتكوين الجسم الجنيني.

بعد 24 ساعة من الحضانة ، انقل اللوحة إلى غطاء المحرك ، وشفط بعناية 120 ميكرولترا من الوسائط باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم شفط الجسم الجنيني عن طريق خفض طرف الماصة بعيدا جدا في البئر.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من وسائط E6 الطازجة ، مكملة ب 2 ميكرومولار XAV939 ومثبطات SMAD لكل بئر. انقل اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة ، واستبدل الوسط يوميا ب E6 المحضر حديثا ، مع استكمال المثبطات.

في اليوم السابع من الحضانة ، تحقق مما إذا كانت جميع الأجسام الجنينية قد وصلت إلى قطر 550 إلى 600 ميكرومتر وتظهر حافة ناعمة وواضحة. في هذه المرحلة ، يكونون جاهزين ليتم تضمينهم في مصفوفة خارج الخلية.

لتضمين العضيات ، قم بإعداد صفائح التضمين المدملة عن طريق وضع لوح فيلم مانع للتسرب بالحرارة بطول 4 بوصات على صندوق P200 فارغ. ثم استخدم أنبوبا مخروطي سعة 15 ملليلتر ، أو أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 500 ميكرولتر ، واضغط برفق على ورقة الفيلم في الثقوب لعمل 12 ، أو العدد المطلوب من الغمازات.

بعد ذلك ، رش 70٪ من الإيثانول على لوح الفيلم ، واتركه يجف داخل الغطاء مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه ، قم بإذابة كمية كافية من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام طرف P200 ذو التجويف العريض ، انقل جسما جنينيا واحدا من الصفيحة المكونة من 96 بئرا إلى كل غمازة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط باستخدام طرف ماصة عادي ، لكن لا تدع الجسم الجنيني يجف.

بعد ذلك ، باستخدام طرف P200 العادي المبرد مسبقا ، أضف ما يقرب من 30 ميكرولترا من مصفوفة الغشاء غير المخففة إلى كل عضوية ، مما يضمن أن الجسم الجنيني قريب قدر الإمكان من مركز القطرة.

بمجرد تضمين جميع الأجسام الجنينية في المصفوفة ، ضع ورقة الفيلم في طبق بتري معقم. ثم احتضان طبق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لمصفوفة الغشاء بالتصلب.

للتمايز العضوي ، أضف 5 ملليلتر من وسائط التمايز المحضرة مع B27 بدون فيتامين أ إلى بئر واحد من لوحة 6 آبار منخفضة للغاية. قم بتسخين الطبق مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. بمجرد أن تصلب مصفوفة الغشاء ، انقل الأجسام الجنينية المدمجة إلى الصفيحة المكونة من 6 آبار عن طريق دفع الدمامل من الجزء الخلفي من لوح الفيلم. إذا لزم الأمر ، استخدم 1 مليلتر من الوسائط من البئر ، وقم بتثبيتها على الورقة لفصل القطرات عن لوح الفيلم.