تقنية الزراعة المشتركة غير المباشرة للخلايا العصبية والخلايا النجمية لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية

ابدأ بلوحة متعددة الآبار تحتوي على غشاء قابل للاختراق مطلي ب poly-D-lysine.

أضف وسط نمو الخلايا النجمية إلى البئر وبذور الخلايا النجمية ، وهي خلية دبقية متخصصة ، في الملحق.

احتضان للسماح بالتصاق الخلية ب poly-D-lysine عبر التفاعلات الكهروستاتيكية وتشكيل طبقة أحادية.

استبدل وسط الخلايا النجمية بوسط زراعة الخلايا العصبية.

انقل هذا الملحق إلى صفيحة متعددة الآبار تحتوي على الخلايا العصبية الجنينية الأولية الملتصقة بالفئران فوق غطاء مغلف بالبوليمر.

احتضن لإنشاء ثقافة مشتركة غير مباشرة للخلايا العصبية والخلايا النجمية ، حيث يتم فصل نوعي الخلايا جسديا ولكنهما يشتركان في نفس وسط الاستزراع.

تفرز الخلايا النجمية العديد من العوامل العصبية الضرورية لبقاء الخلايا العصبية ونموها.

تهاجر هذه العوامل من خلال الدعم المنفذ وتتفاعل مع الخلايا العصبية الأولية. هذا يعزز تمايزها ويشكل إسقاطات عصبية.

تستطيل هذه الإسقاطات وتنشئ روابط متشابكة بين الخلايا العصبية ، مما يشير إلى التفاعلات بين الخلايا العصبية الدبقية.

قم بتغطية كل إدراج ب 10 ميكروغرام لكل مليلتر من بولي د-يسين واحتضانه لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، اغسل الإدخالات مرتين باستخدام PBS.

في غضون ذلك ، قم بشفط وسط الخلايا النجمية واغسل المزرعة مرة واحدة باستخدام 10 مل من PBS لضمان إزالة المصل المتبقي. بعد ذلك ، أضف 3 ملليلتر من 0.05٪ تريبسين EDTA إلى القوارير ، واحتضان الخلايا للتربسين لمدة 10 دقائق تقريبا. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا برفق في 7 ملليلتر من وسط الخلايا النجمية.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 216 مرة جم. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مليلتر من وسط الخلايا النجمية. عد الخلايا باستخدام غرفة العد. بعد ذلك ، املأ اللوحة المكونة من 24 بئرا ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا النجمية لكل بئر. استنشق PBS ونقل 25,000 خلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلايا النجمية إلى كل إدخال فردي ، واحتضان الثقافة عند 37 درجة مئوية.

لتشريح الحصين ، قم بإعداد ثلاثة أطباق بطول 10 سم مليئة بوسط التحضير وأنبوب واحد سعة 2 مليلتر مع 1 مليلتر من وسط التحضير. قم بتشريح الحصين من شقوق القشرة واجمعها في أنبوب سعة 2 ملليلتر مملوء بوسط التحضير.

من الأهمية بمكان عزل الحصين دون أي أنسجة مجاورة من مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي. لذلك ، بعد إزالة الحصين ، يجب إزالة الأنسجة الملوثة الأجنبية بشكل إضافي.

بعد التشريح ، انقل الأنبوب إلى مقعد تدفق رقائقي معقم. قم بإزالة وسط التحضير بعناية ، وهضم أنسجة الحصين ب 1 مليلتر من محلول الهضم الذي يحتوي على غراء. بعد 15 دقيقة من الهضم ، اسحب محلول الهضم بعناية عن طريق الشفط اللطيف باستخدام ماصة.

نظرا للحساسية العالية للخلايا العصبية ، من الأهمية بمكان أن تنضج الحصين بعناية لتجنب الفقاعات والحصول على شدة التريتوري المثلى.

اغسل الحصين ثلاث مرات بوسط الخلايا العصبية عن طريق إضافة وشفط 1 مل من وسط الثقافة الطازجة بعناية لكل دورة غسيل. بعد خطوة الغسيل النهائية ، قم بترتيتويت الأنسجة بعناية في 1 مليلتر من وسط الخلايا العصبية. ثم عد الخلايا باستخدام غرفة العد. لوحة 35,000 خلية في 500 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية لكل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضان الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

الآن ، خذ الإدخالات المحضرة ، التي تم زرعها بطبقات أحادية الخلايا النجمية المتقاربة من الحاضنة. استبدل الوسط عن طريق شفط وسط الخلايا النجمية واستبداله ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا العصبية الطازجة.

بعد ذلك ، ضع الإدخالات التي تحتوي على الخلايا النجمية بعناية في الآبار التي تحتوي على مزارع الخلايا العصبية باستخدام ملقط معقم. بعد ذلك ، ضع الثقافة المشتركة للخلايا النجمية العصبية غير المباشرة الناتجة مرة أخرى في الحاضنة حتى التجارب.