عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن قشرة دماغ الفأر البالغ

خذ قشرة دماغ الفأر التي تم حصادها حديثا.

يقطع الأنسجة إلى أجزاء صغيرة. انقلها إلى الخالط المبرد الذي يحتوي على مخزن مؤقت مع مثبطات RNase و DNases.

تجانس الأنسجة على النحو الأمثل لتحرير الخلايا في التعليق ، والحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي نظرا لقدرتها على تحمل قوى القص والحفاظ على بقاء الغشاء ، مع القضاء على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأخرى.

علاوة على ذلك ، تعمل مثبطات RNase على تحلل RNases ، بينما تعمل DNases على تحلل أي DNA ملوث.

مرر معلق الخلية عبر مصفاة خلوية لإزالة بقايا الأنسجة.

نقل تعليق الخلية إلى أنبوب. جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية المحتوية على الإنزيمات. قم بإعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت.

أضف الميكروبيدات المغناطيسية المضادة للمايلين. تستهدف هذه الميكروبيدات بروتين المايلين ، وتربط بقايا المايلين والخلايا قليلة التغصن.

قم بتحميل خليط خلية الخرز في عمود استنفاد يتكون من مصفوفة ذات كرات مغناطيسية حديدية.

تحت المجال المغناطيسي المطبق ، يتم الاحتفاظ بحطام المايلين المرتبط بالميكروبيدات والخلايا قليلة التغصن داخل العمود ، بينما تمر الخلايا الدبقية الصغيرة من خلالها.

اغسل العمود بالمخزن المؤقت واجمع التدفق الذي يحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة.

أولا ، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع كل منطقة من مناطق الدماغ إلى قطع دقيقة أقل من 1 ملليمتر مكعب. باستخدام ماصة سعة 1 مليلتر مع قطع طرفها، انقل قطع المناديل إلى مجانسات Dounce مبردة مسبقا. قم بتجانس الأنسجة عن طريق لف المكبس ببطء داخل وخارج الخالط Dounce لمدة 6 إلى 10 ضربات كاملة حتى لا توجد قطع مرئية. بعد ذلك ، انقل الأنسجة المنفصلة إلى أنابيب سعة 50 مليلتر من خلال مصافي 70 ميكرومتر.

اشطف كل خالط ومكبس Dounce بإجمالي 6 مل من الوسط البارد A ، ثم انقل الشطف إلى أنبوب سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. نظام التعليق أحادي الخلية لأجهزة الطرد المركزي عند 400 مرة جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق مع استراحة عند 5.

اشطف عمود استنفاد كبير وثلاثة أعمدة اختيار كبيرة في فاصل مغناطيسي مع 3 ملليلتر من MCS. عند اكتمال الطرد المركزي لعينات الأنسجة، قم بإخراج الماصة والتخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت MCS الذي يحتوي على مثبط RNase.

أضف 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا معلقة من القشرة والمخيخ ، وأضف 50 ميكرولترا من حبات إزالة المايلين إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا معلقة من الحصين والمخطط. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف MCS إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا قشرية لرفع حجمه إلى 2 مليلتر ، وإلى الأنابيب المتبقية لرفع كل حجم من أحجامها إلى 1 ملليلتر. بمجرد أن تصبح الأعمدة فارغة من المخزن المؤقت للشطف ، قم بتحميل 2 ملليلتر من الخلايا القشرية على عمود النضوب الكبير و 1 مليلتر من تعليق الخلية الأخرى على أعمدة اختيار كبيرة منفصلة. بعد ذلك ، اغسل عمود النضوب الكبير مرة واحدة باستخدام 1 مليلتر من المخزن المؤقت MCS ، واغسل كل عمود تحديد كبير مرتين باستخدام 1 مليلتر من المخزن المؤقت MCS لكل غسلة.