تقنية بسيطة لعزل وزراعة الخلايا النجمية الفئرانية

قطع قشرة الفأر إلى قطع صغيرة ونقلها إلى وسط تشريح بارد يحتوي على محلول ملح مخزز.

أضف الإنزيمات الهاضمة لفصل المصفوفة خارج الخلية.

لإزالة الإنزيمات المتبقية ، اغسلها بوسط التشريح البارد.

استبدل هذه الوسيلة بوسط تخصيب الخلايا النجمية.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لفصل قطع الأنسجة.

مرر المعلق عبر مصفاة لإزالة الأنسجة غير المنفصلة والحصول على خلايا مفردة.

انقل الخلايا إلى صفيحة مطلية بالبوليمر موجبة الشحنة. احتضان مع الرج.

تلتصق الخلايا النجمية بقوة ، بينما تنفصل الخلايا العصبية غير المرتبطة بشكل فضفاض ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا الدبقية قليلة التغصن.

يحول وسط التخصيب الخلايا النجمية الناضجة إلى خلايا نجمية متعددة الأضلاع مقسمة

قم بإزالة الخلايا المنفصلة واغسل الخلايا النجمية بمخزن مؤقت للفوسفات.

أضف الإنزيمات الهاضمة لفصل الخلايا النجمية.

أضف وسيطا يحتوي على مصل لإيقاف النشاط الأنزيمي. اجمع الخلايا النجمية في أنبوب وجهاز طرد مركزي.

تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط نضج الخلايا النجمية لتعزيز بنية الخلايا النجمية الناضجة النموذجية على شكل نجمة.

قطع أي نسيج قشري لاستخدامه لتوليد الخلايا النجمية إلى قطع لا يزيد حجمها عن 1 ملليمتر مكعب. بمجرد جمع جميع قطع المناديل ، انتظر حتى تستقر في قاع الأنبوب. ثم استنشق أكبر قدر ممكن من المتوسط. بعد ذلك ، أضف 2 إلى 3 ملليلتر من 0.05٪ تريبسين EDTA ، واحتضان العينات في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بشفط التربسين EDTA بعناية ، مع ترك قطع المناديل في الحد الأدنى من السائل في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 5 مل من وسط التشريح المبرد مسبقا لغسل ما تبقى من التربسين EDTA ، والماصة إلى جانب الأنبوب العلوي لتحقيق خلط قطع الأنسجة. ثم استنشق وسط التشريح واترك قطع المناديل في أقل قدر ممكن من السائل.

كرر خطوة الغسيل هذه مع وسيط التشريح المبرد مسبقا مرتين. بعد خطوة الغسيل النهائية، أضف 1 ملليلتر من DMEM PLUS بدرجة حرارة الغرفة وقم بمعايرة الأنسجة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات.

الخلايا

النجمية حساسة جدا لدرجة الحموضة ، لذلك من المهم تجنب إنتاج الفقاعات لأن هذا قد يغير درجة الحموضة في المحلول.

بعد ذلك ، ضع مصفاة خلية 100 ميكرون في فتحة أنبوب سعة 50 مليلتر وبلل الفلتر مسبقا ب 4.5 مل من DMEM PLUS المبرد مسبقا. ماصة 1 مليلتر من تعليق الأنسجة المنفصلة على مصفاة الخلية ، وأضف 4.5 مل أخرى من DMEM PLUS المبرد مسبقا لغسل الخلايا من خلالها. في اليوم في المختبر 7 بعد التشريح ، ضع الأطباق التي يبلغ طولها 10 سم مع الخلايا في DMEM PLUS على شاكر في الحاضنة ورج الأطباق بسرعة 110 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات.

قبل 20 إلى 30 دقيقة من نهاية الاهتزاز لمدة ست ساعات ، قم بالتسخين المسبق 1X PBS و DMEM PLUS و NB + H و 0.25٪ تريبسين EDTA إلى 37 درجة في الحمام المائي. بعد ست ساعات من الاهتزاز ، انزع أطباق الثقافة من الخلاط ، واستبدل الوسط على الفور ب 10 مل من 1X PBS الدافئ مسبقا لكل طبق. بعد ذلك ، قم بإزالة PBS وأضف 3 ملليلتر من التربسين EDTA الدافئ مسبقا لكل طبق.

ثم احتضان العينات لمدة أربع دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 5 مل من DMEM PLUS المسخن مسبقا إلى 3 ملليلتر من التربسين EDTA في كل طبق. قم بإخراج الخلايا من الطبق وجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 3,220 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية ، ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مليلتر من NB + H الدافئ مسبقا.